Aislamiento de vesículas extracelulares de plaquetas

Abstract

[spa] El plasma rico en plaquetas (PRP) es un componente muy utilizado en medicina regenerativa, debido a la liberación de factores de crecimiento y de proteínas capaces de maximizar el proceso de reparación a nivel celular. Pese a los buenos resultados obtenidos, el PRP tiene varios inconvenientes, como la necesidad de utilizar plaquetas autólogas o la falta de protocolos estandarizados para su uso terapéutico. En este estudio se sugieren las vesículas extracelulares (EV) derivadas de concentrados de plaquetas, y concretamente, los exosomas, como una alternativa al uso de PRP en medicina regenerativa. Las EV son partículas envueltas por una membrana que son liberadas activamente por las células, se pueden encontrar en todos los tipos de tejidos y fluidos corporales. Las EV presentan serias ventajas sobre el PRP, como el no requerimiento de sangre autóloga y evita la variabilidad derivada de los diferentes métodos de obtención de PRP. En la realización de este trabajo se han asilado las EV de las muestras de lisado de plaquetas (LP) a través de diferentes métodos (ultracentrifugación, precipitación con polietilenglicol (PEG) y el kit comercial Exo-spin™) demostrando que es posible aislar y purificar las EV del LP. Se han caracterizado usando la microscopia electrónica de transmisión (TEM) y la dispersión dinámica de la luz (DLS), demostrando que el método de aislamiento seleccionado influye notablemente en el tamaño de las partículas resultantes. Se ha cuantificado la proteína total presente en cada uno de los aislados mediante el método del ácido bicinconínico (BCA). Como medida adicional, se realizó un estudio piloto para evaluar como influían los diferentes tipos de aislados de EV sobre la actividad metabólica en una línea celular de pre-osteoblastos de ratón. Se demostró que la precipitación con PEG era el método que daba unos mejores resultados, así, se obtenían EV de menor tamaño, una mayor cantidad de proteína total y además se conseguía un inducir un aumento de la actividad metabólica de los pre-osteoblastos de ratón similar al aumento que inducía el LP. Sugiriendo que una parte importante del efecto regenerativo llevado a cabo por el LP es debido al efecto de los exosomas presentes.

[eng] Platelet-rich plasma (PRP) is a widely used component in regenerative medicine, due to the release of growth factors and proteins capable of maximizing the repair process at the cellular level. Despite the good results obtained, PRP has several disadvantages, such as the need to use autologous platelets or the lack of standardized protocols for therapeutic use. In this study we suggest extracellular vesicles (EV) derived from platelet concentrates, and specifically exosomes, as an alternative to the use of PRP in regenerative medicine. EV are particles surrounded by a membrane that are actively released by the cells, can be found in all types of tissues and body fluids. The EV present serious advantages over PRP, such as the non-requirement of autologous blood and avoid the variability derived from the different methods of obtaining PRP. In this work the EV of platelet lysate (LP) samples were isolated by different methods (ultracentrifugation, precipitation with polyethylene glycol (PEG) and the commercial Exo-spin™ kit), demonstrating that it is possible to isolate and purify EV from LP. They have been characterized using transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS), demonstrating that the selected isolation method influences significantly the size of the resulting particles. The total protein present in each of the isolates was quantified by the BCA method. As a further measure, a pilot study was conducted to evaluate how the different EV isolates influenced metabolic activity in a mouse pre-osteoblast cell line. It was shown that PEG precipitation was the method that gave better results, thus, smaller EV were obtained, a greater amount of total protein and an induction of an increase in the metabolic activity of the mouse pre-osteoblasts similar to the increase induced by LP. Suggesting that an important part of the regenerative effect carried out by LP is due to the effect of the present exosomes.