Implicaciones ecológicas y clínicas del análisis comparativo de genomas de micobacterias ambientales y patógenas

Abstract

[spa] El objetivo principal de la presente tesis es realizar un estudio detallado desde el punto de vista genómico de todas aquellas características que pueden beneficiar el carácter patogènico de las micobacterias de crecimiento rápido (MCR), en especial de las especies estrechamente relacionadas Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae y Mycobacterium immunogenum. Dichas especies son consideradas como importantes patógenos oportunistas, responsables de infecciones difíciles de tratar por sus características intrínsecas y que complican el estado de salud de los pacientes hospitalizados. Además, con este estudio se pretende compensar el desequilibrio histórico existente en cuanto al estudio del género Mycobacterium, donde los esfuerzos se han centrado fundamentalmente en especies patógenas como Mycobacterium tuberculosis. Incrementar la información disponible de las MCR mencionadas permitirá futuros estudios centrados en la investigación de los elementos de patogenicidad que poseen, así como proponer nuevas dianas para el desarrollo de tratamientos alternativos de las infecciones que provocan. Con el fin de abordar el problema del escaso número de genomas presentes en las bases de datos de las especies mencionadas; se desarrolló un protocolo de extracción de ADN eficaz para micobacterias, consideradas como microorganismos difíciles de lisar. Obtenidas las muestras de ADN, se utilizaron tecnologías de secuenciación de nueva generación para la obtención de grandes cantidades de secuencias (denominadas lecturas) a partir de las cuales se obtuvieron los genomas de las respectivas cepas. Con este fin se utilizaron las herramientas bioinformáticas más óptimas de las disponibles para el ensamblaje, mejora y evaluación de los genomas obtenidos. De esa forma se aseguró la obtención de genomas de alta calidad con las herramientas disponibles en el momento. Los genomas obtenidos, junto con los disponibles en las bases de datos, se utilizaron para el estudio comparativo basado en el cálculo del genoma esencial (que incluye el conjunto de proteínas compartidas por todos los genomas) y pangenoma (conjunto de todos los grupos de proteínas diferentes presentes en un conjunto de genomas). El genoma esencial permitió clarificar las relaciones evolutivas de las diferentes especies consideradas, especialmente en el complejo de subespecies de M. abscessus. El estudio del pangenoma permitió sugerir una alta capacidad adaptativa de las MCR debido a la tendencia abierta detectada en su pangenoma. El mismo resultado se obtuvo en el grupo abscessuschelonae-immunogenum, pero no en la especie M. immunogenum, donde la tendencia cerrada del pangenoma refleja la escasa plasticidad genómica de la especie. Un hito importante conseguido fue la caracterizaron funcional de las proteínas exclusivas de una determinada especie o genoma. En este sentido, se realizó un catálogo de todos aquellos elementos genómicos implicados en la patogenicidad de cada microorganismo. Para ello se utilizaron toda una serie de bases de datos especializadas para la búsqueda de genes de resistencias a antibióticos, factores de virulencia, elementos móviles, proteínas reguladoras y elementos implicados en la percepción del Quórum. De esta forma se determinó un extenso catálogo de elementos genéticos que pueden influir de forma decisiva en la patogenicidad de cada cepa analizada. Finalmente, se caracterizaron los llamados sistemas toxina-antitoxina (STA), cuya funcionalidad puede influir en la patogenicidad de los microorganismos. En este caso no solo se utilizaron toda una serie de bases de datos especializadas y herramientas bioinformáticas para la descripción de estos elementos, sino que también se estableció un protocolo para realizar el ensayo experimental de su funcionalidad, utilizando a Escherichia coli como hospedador y vectores de expresión donde se clonaron los genes de la toxina y la antitoxina por separado. De esta forma se consiguió la descripción completa desde el punto de vista genómico, estructural y funcional de todos los sistemas detectados en las micobacterias objeto de estudio, observando resultados compatibles con un STA en tres ellos.

[cat] L’objectiu principal de la present tesis es realizar un estudi detallat desde el punt de vista genòmic de totes aquelles caracteristiques que poden bneficiar el caràcter patogènic de les micobacteris de creixement ràpid (MCR), en especial de les espècies estretament relacionades Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae y Mycobacterium immunogenum. Les espècies esmentades es consideren importants patògens oportunistes, responsables d’infeccions difícils de tractar degut a les seves característiques intrínseques i que compliquen l’estat de salut dels pacients hospitalitzats. A més a més, amb aquest estudi es pretén compensar el desequilibri històric existent en quant a l’estudi del gènere Mycobacterium, on l’esforç s’ha centrat fonamentalment en espècies patògenes com Mycobacterium tuberculosis. Incrementar la informació disponible de les MCR esmentades permetrá futurs estudis centrats en la investigació dels elements de patogenicitat que posseeixen, així com proposar noves dianes per al desenvolupament de tractaments alternatius de les infeccions que provoquen. Amb la finalitat d’abordar el problema de l’escàs nombre de genomes presents en els bases de dades de les espècies destacades, es va desenvolupar un protocol d’extracció d’ADN eficaç per micobacteris, considerades com a microorganismes difícils de lisar. Un cop obtingudes les mostres d’ADN, s’empraren tecnologies de seqüenciació de nova generació per a l’obtenció de grans quantitats de seqüencies (denominades lectures) a partir de les quals es varen obtindre els genomes de les respectives soques. Amb aquest objectiu es varen utilitzar les eines bioinformàtiques més òptimes de les disponibles per a l’ensamblatje, millora y evaluació dels genomes obtinguts. D’aquesta manera es va asegurar l’obtenció de genomes d’alta qualitat amb les eines disponibles en el moment. Els genomes obtinguts, juntament amb els disponibles en les bases de dades, es varen utilitzar per a l’estudi comparatiu basat en el càlcul del genoma esencial (que inclou el conjunt de proteïnes compartides per tots els genomes) y pangenoma (conjunt de tots els grups de proteïnes diferents presents en un conjunt de genomes). El genoma esencial va permetre aclarir les relacions evolutives de les diferents espècies considerades, especialment en el complexe de subespècies de M. abscessus. L’estudi del pangenoma va permetre sugerir una alta capacitat adaptativa de les MCR degut a la tendència oberta detectada en el pangenoma. El mateix resultat es va obtenir en el grup abscessuschelonae-immunogenum, pero no en la espècie M. immunogenum, en la que la tendència tancada del pangenoma reflecteix la baixa plasticitat genòmica de l’espècie. Un fet important aconseguit va ser la caracterització funcional de les proteïnes exclusives d’una espècie determinada o genoma. En aquest sentit, es va realitzar un catàleg de tots aquells elements genòmics implicats en la patogenicitat de cada microorganisme. Per aconseguir-ho es varen utilitzar tota una sèrie de bases de dades especialitzades per a la recerca de gens de resistència a antibiòtics, factors de virulència, elements mòvils, proteïnes reguladores y elements implicats en la percepció del Quòrum. D’aquesta forma es va determinar un extens catàleg d’elements genètics que poden influir de manera decisiva en la pateogenicitat de cada soca analitzada. Finalment, es caracteritzaren els coneguts com a sistemes toxina-antitoxina (STA), la funcionalitat dels cuals pot influir en la patogenicitat dels microorganismes. En aquest cas no tan sols es varen utilitzar tota una sèrie de bases de dades especialitzades y eines bioinformàtiques per a la descripció d’aquests elements, sinó que també es va establir un protocol per realitzar l’assaig experimental de la seva funcionalitat, emprant a Escherichia coli com hospedador y vectors d’expresió on es varen clonar els gens de la toxina i la antitoxina per separat. D’aquesta manera es va aconseguir la descripció completa des del punt de vista genòmic, estructural i funcional de tots els sistemas detectats en els micobacteris objecte d’estudi, observant resultats compatibles amb un STA en tres dels sistemes detectats.

[eng] The main objective of the present thesis is to perform a detailed study from a genomic point of view of all those characteristics that can benefit the pathogenicity of the rapid growing mycobacteria (RGM), especially of the closely related species Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae and Mycobacterium immunogenum. These species are considered important opportunistic pathogens, responsible of infections that are hard to treat due to their intrinsic characteristics. These infections complicate the health status of the hospitalized patients. In addition, this study pretends to compensate the historical imbalance in the study of the genus Mycobacterium, in which the efforts have been put in the study of pathogenic species as Mycobacterium tuberculosis. Increasing the information available of the RGM mentioned before in the databases will allow future studies to be focused on the research of the pathogenicity elements that they have, as well as propose new targets for the development of alternative treatments of the infections that they provoke. With the objective to increase the actual low number of genomes present in the databases of the species mentioned before, it was developed a DNA extraction protocol effective for mycobacteria, considered as “hard-to-lyse” microorganism. Having obtained the DNA samples, next-generation sequencing technologies were used to obtain massive amounts of sequences (called reads) from which the genomes of the respective strains were obtained. With this purpose, the most suitable and available bioinformatic tools were used for the assembly, improvement and checking of the genomes obtained. Thus, it was ensured the obtention of high-quality genomes with the tools available at that moment. The resulting genomes, along with the genomes available in the databases, were used for a comparative study based on the estimation of the core genome (which includes all the proteins shared by all the genomes) and the pangenome (set of all the groups of different proteins present in all the studied genomes). The core genome allowed to clarify the evolutive relationships among the species considered, especially inside the complex of subspecies of M. abscessus. The determination of the pangenome allowed to suggest a high adaptive capacity of the RGM group due to the open tendency observed in its pangenome. The same result was obtained in the group abscessus-chelonae- immunogenum, but not in the species M. immunogenum, in which the closed tendency reflects the limited genomic plasticity of the species. An important achievement was the characterization of the proteins exclusive of one specific species or genome. In this sense, it was obtained a detailed catalogue of all those genomic elements related with the pathogenicity of each microorganism using specialized databases to find genes related to antibiotic resistances, virulence factors, mobile genetic elements, regulatory proteins and elements related to the Quorum sensing. Consequently, it was determined a large catalogue of genetic elements that can influence decisively in the pathogenicity of each strain. Finally, the elements called toxin-antitoxin systems (TAS) were characterized. The functionality of these elements can be closely related with the pathogenicity of the microorganisms. In this case, in addition to the use of specialized databases and bioinformatic tools for the description of these elements, it was developed a protocol for the experimental assay of their functionality. For this purpose, it was used Escherichia coli as host and expression vectors where the genes of the toxins and antitoxins were cloned separately. With this procedure, the TAS were completely described from the genomic, structural and functional point of view, obtaining results compatible with a TAS in three of them.