Catabolismo y tolerancia a hidrocarburos en el linaje Roseobacter. Aproximación multiómica

Abstract

[spa] Una de las características del linaje Roseobacter es su capacidad para la degradación de compuestos aromáticos. En la presente tesis se ha realizado una aproximación detallada de la capacidad para degradar compuestos aromáticos en el linaje Roseobacter determinando la presencia y organización de 166 genes involucrados en 6 vías de degradación de compuestos centrales anteriorment estudiadas en este grupo (rama del protocatecuato de la vía del betacetoadipato, benzoil-CoA, gentisato, fenilacetil-CoA, homoprotocatecuato y homogentisato) así como en las dos ramas de la vía central del catecol, en la rama de la rotura meta del anillo aromático del protocatecuato y en todas las vías periféricas que convergen en estas rutas centrales en 61 genomas de Roseobacter. Se determinó que las vías de degradación más detectadas eran la rama del protocatecuato de la vía del beta-cetoadipato y las vías de degradación del homogentisato y fenilacetil-CoA. Además, se observó una gran variabilidad en la organización de los genes para estas rutas catabólicas en los diferentes genomas. También se analizó la capacidad de varios aislados para crecer a expensas de los compuestos aromáticos estudiados como única fuente de carbono y energía y no siempre se cumplieron los resultados esperados en base a la predicción genómica. Por otra parte, no solo se ha estudiado el potencial para el catabolismo de compuestos aromáticos sino también los mecanismos de tolerancia a dos compuestos aromáticos (naftaleno y tolueno) que presentan miembros del linaje Roseobacter. En los cultivos expuestos a naftaleno se detectaron cambios a nivel de proteínas implicadas en el mantenimiento de la estabilidad de la membrana, la respuesta al estrés oxidativo y el transporte de membrana. Por lo tanto, los miembros del linaje Roseobacter presentaban algunos de los mecanismos implicados en la tolerancia a compuestos aromáticos descritos en la literatura en otros grupos bacterianos. Por último, se estudiaron las diferencias a nivel taxonómico y funcional entre las comunidades microbianas de aguas costeras no contaminadas (control) y aguas contaminadas con hidrocarburos en base a la generación de ocho metagenomas: dos de muestras ambientales y seis a partir de experimentos de microcosmos. A nivel de los metagenomas ambientales se pudo observar que en el metagenoma de puerto había una menor detección de secuencias asignadas a alfaproteobacterias y cianobacterias y una mayor detección de gammaproteobacterias y flavobacterias respecto al agua control, confirmando los resultados de anteriores estudios basados en ARNr. A nivel de metagenomas generados a partir de experimentos de microcosmos, también se observaron diferencias a nivel taxonómico, aunque estas fueron menos evidentes que las del metagenoma de puerto. Estos cambios a nivel taxonómico fueron acompañados de cambios a nivel funcional, por ejemplo, se observó que en los metagenomas de aguas contaminadas con hidrocarburos se solían encontrar genes codificantes para enzimas implicadas sobre todo en la degradación de compuestos derivados de combustibles fósiles y de la lignina mientras que en los metagenomas controles predominaban genes codificantes para enzimas de las que se desconoce el tipo de compuestos sobre los que actúan.

[cat] Una de les característiques del llinatge Roseobacter és la seva capacitat per a la degradació de compostos aromàtics. En la present tesi s’ha realitzat una aproximació detallada de la capacitat per degradar compostos aromàtics en el llinatge Roseobacter determinant la presència i organització de 166 gens involucrats en 6 vies de degradació de compostos centrals que ja havien estat estudiats en aquest grup (branca del protocatecuat de la via del betacetoadipat, benzoil-CoA, gentisat, fenilacetil-CoA, homoprotocatecuat i homogentisat) així com en les dues branques de la via central del catecol, en la branca del trencament meta de l’anell aromàtic del protocatecuat i en totes les vies perifèriques que convergeixen en aquestes rutes centrals en 61 genomes de Roseobacter. Es va determinar que les vies de degradació més detectades eren la branca del protocatecuat de la via del beta-cetoadipat i les vies de degradació de l’homogentisat i el fenilacetil-CoA. A més, es va observar una gran variabilitat en l’organització dels gens per a aquestes rutes catabòliques en els diferents genomes. També es va analitzar la capacitat de diversos aïllats per créixer a costa dels composts aromàtics estudiats com a única font de carboni i energia i no sempre es van complir els resultats esperats a partir de la predicció genòmica. D’altra banda, no sols s’ha estudiat el potencial per al catabolisme de compostos aromàtics sinó també els mecanismes de tolerància a dos compostos aromàtics (naftalè i toluè) que presenten membres del llinatge Roseobacter. En els cultius exposats a naftalè es van detectar canvis a nivell de proteïnes implicades en el manteniment de l’estabilitat de la membrana, la resposta a l’estrès oxidatiu i el transport de membrana. Per tant, els membres del llinatge Roseobacter presentaven alguns dels mecanismes implicats en la tolerància a compostos aromàtics descrits en la literatura en altres grups bacterians. Finalment, es van estudiar les diferències a nivell taxonòmic i funcional entre les comunitats microbianes d’aigües costaneres no contaminades (control) i aigües contaminades amb hidrocarburs a partir de la generació de vuit metagenomes: dos de mostres ambientals i sis a partir d’experiments de microcosmos. A nivell dels metagenomes ambientals es va poder observar que en el metagenoma de port hi havia una menor detecció de seqüències assignades a alfaproteobacteris i cianobacteris i una major detecció de gammaproteobacteris i flavobacteris respecte a l’aigua control, confirmant els resultats d’estudis anteriors basats en ARNr. A nivell de metagenomes generats a partir d’experiments de microcosmos, també es van observar diferències a nivel taxonòmic, encara que aquestes van ser menys evidents que les del metagenoma de port. Aquests canvis a nivell taxonòmic van ser acompanyats de canvis a nivell funcional, per exemple, es va observar que en els metagenomes d’aigües contaminades amb hidrocarburs es solien trobar gens codificants per a enzims implicats sobretot en la degradació de compostos derivats de combustibles fòssils i de la lignina mentre que en els metagenomes control predominàven gens codificants per a enzims dels quals es desconeix el tipus de substrat sobre el qual actuen.

[eng] One characteristic of the Roseobacter lineage is its capacity for the degradation of aromatic compounds. In this thesis a detailed analysis of the capacity to degrade aromatic compounds in the Roseobacter lineage has been done by determining the presence and organization of 166 genes involved in 6 degradation pathways of central compounds previously studied in this group (protocatechuate branch of the beta-ketoadipate pathway, benzoyl-CoA, gentisate, phenylacetyl-CoA, homoprotocatechuate, and homogentisate) as well as in the two branches of the central catechol pathway, in the branch of meta-cleavage of the protocatechuate ring and in all peripheral pathways that converge in these central routes in 61 Roseobacter genomes. The most detected degradation pathways were the protocatechuate branch of the beta-ketoadipate pathway and the degradation pathways of homogentisate and phenylacetylCoA. In addition, a great variability in the organization of the genes for these catabolic routes was observed in the different genomes. The ability of several isolates to grow at the expense of the aromatic compounds studied as the sole source of carbon and energy was also analyzed and the expected results based on genomic prediction were not always fulfilled. On the other hand, we have also analysed the mechanisms of tolerance to two aromatic compounds (naphthalene and toluene) of members of the Roseobacter lineage. In cultures exposed to naphthalene, changes in proteins involved in the maintenance of membrane stability, response to oxidative stress and membrane transport were detected. Therefore, members of the Roseobacter lineage presented some of the mechanisms involved in tolerance to aromatic compounds described in the literature for other bacterial groups. Finally, differences at taxonomic and functional level between microbial communities of unpolluted coastal waters (control) and waters contaminated with hydrocarbons were studied based on the generation of eight metagenomes: two of environmental samples and six from microcosm experiments. In the harbor metagenome there was less detection of sequences assigned to alphaproteobacteria and cyanobacteria and a greater detection of gammaproteobacteria and flavobacteria with respect to the control water, confirming the results of previous studies based on rRNA. In the metagenomes generated from microcosm experiments, differences at taxonomic level were also observed, although these were less evident than those of the harbor metagenome. The changes at taxonomic level were accompanied by changes at functional level. In metagenomes from contaminated waters sequences for genes coding for enzymes involved mainly in degradation of compounds derived from fossil fuels and lignin were observed. In control metagenomes genes encoding enzymes whose substrates are unknown were more prevalent.