Efecto de la mutación de mucA y eftM sobre la patogenicidad de Pseudomonas aeruginosa

Abstract

[spa] Introducción: Pseudomonas aeruginosa es el principal responsable de las infecciones crónicas en los pacientes con fibrosis quística, en los que causa una elevada tasa de morbilidad y mortalidad. En estas infecciones, el microorganismo sufre numerosas adaptaciones que le permiten sobrevivir en el ambiente hostil del pulmón y que dificultan la erradicación de la infección. Entre estas adaptaciones se encuentran la mutación de mucA y la trimetilación del factor de elongación Tu (EF-Tu). La mutación de mucA confiere el fenotipo mucoide por hiperproducción del exopolisacárido de alginato y su aparición se asocia a un mal pronóstico de la enfermedad. La trimetilación de EF-Tu la realiza la metiltransferasa EftM, generando un epítopo estructuralmente similar a la fosforilcolina, que facilita la interacción con las células del huésped. En esta tesis hemos profundizado en el estudio del impacto que tienen estas dos adaptaciones sobre la patogenicidad de P. aeruginosa. Contenido de la investigación: En una primera parte, se ha investigado el efecto de la mutación de mucA, sobre la capacidad de invasión y diseminación del microorganismo y los mecanismos moleculares y celulares que subyacen en este efecto. Para ello se ha analizado la capacidad de alterar y atravesar un epitelio respiratorio humano polarizado por parte de una colección de aislados, mucoides y no mucoides, procedentes tanto de infecciones respiratorias agudas como crónicas, una cepa de laboratorio y el mutante isogénico deficiente en mucA derivado de ella. Nuestros resultados han demostrado que el fenotipo mucoide se asocia a una menor capacidad para alterar y cruzar la barrera epitelial. P. aeruginosa altera la permeabilidad del epitelio gracias a la reducción de los niveles de una proteína esencial en la unión entre células, ZO-1. Esta reducción está mediada por la acción de las exotoxinas bacterianas ExoS y ExoT y por la activación del factor de transcripción celular NF-kB inducida por el patógeno. La mutación de mucA reduce la expresión de las exotoxinas y la capacidad del microorganismo para inducir la activación de NF-kB. Estos dos hechos, junto con la menor movilidad que presenta el mutante deficiente en mucA, contribuyen a la reducida capacidad invasora que presentan las cepas mucoides. En una segunda parte, se ha investigado el impacto de la trimetilación de EF-Tu sobre la patogenicidad del microorganismo mediante el análisis del proteoma global de la cepa de laboratorio PAO1 y la cepa HM4, procedente de una infección crónica, los respectivos mutantes isógenicos deficientes en la metiltransferasa responsable de la modificación (EftM) y los correspondientes mutantes complementados. Nuestros resultados han demostrado que la modificación de EF-Tu altera de forma muy discreta un número muy reducido de proteínas que hasta la fecha no han sido implicadas en la patogenicidad del microorganismo. Sin embargo, los resultados obtenidos en un modelo murino de neumonía demuestran que la deficiencia de EftM reduce la virulencia de P. aeruginosa. Conclusiones: La mutación de mucA reduce la capacidad invasora de P. aeruginosa debido a que afecta a los mecanismos que el microorganismo utiliza para alterar la permeabilidad de la barrera epitelial; la reducción de la proteína de unión intercelular ZO-1 mediada por la acción de las exotoxinas y la inducción de la activación de NF-kB. Este hecho podría determinar el confinamiento de las cepas mucoides en el pulmón de los pacientes con fibrosis quística. El impacto de la trimetilación de EF-Tu sobre la patogenicidad de P. aeruginosa parece residir únicamente en la generación de un dominio estructural similar a la fosforilcolina que facilita la interacción del microorganismo con las células humanas

[cat] Introducció: Pseudomonas aeruginosa es el principal responsable de les infeccions cròniques en pacients amb fibrosis quística, als quals causa una elevada taxa de morbiditat i mortalitat. En aquestes infeccions, el microorganisme sofreix nombroses adaptacions que li permeten sobreviure a l’ambient hostil del pulmó i que dificulten l’erradicació de la infecció. Entre aquestes adaptacions es troba la mutació de mucA i la trimetilació del factor d’elongació Tu (EF-Tu). La mutació de mucA confereix el fenotip mucoid per hiperproducció de l’exopolisacárid d’alginat i la seva aparició s’associa a un mal pronòstic de la malaltia. La trimetilació de EF-Tu la realitza la metiltransferasa EftM, generant un epítop estructuralment semblant a la fosforilcolina, que facilita la interacció amb les cèl·lules de l’hoste. En aquesta tesis hem aprofundit en l’estudi de l’impacte que tenen aquestes dues adaptacions sobre la patogenicitat de P. aeruginosa. Contingut de la recerca: En una primera part, s’ha investigat l’efecte de la mutació de mucA, en la capacitat d’invasió i disseminació del microorganisme i els mecanismes moleculars i cel·lulars subjacents a aquest efecte. Per a això s’ha analitzat la capacitat d’alterar i travessar un epiteli respiratori humà polaritzat per part d’una col·lecció d’aïllats, mucosos i no mucosos, procedents tant d’infeccions respiratòries agudes como cròniques, una soca de laboratori i el mutant isogènic deficient en mucA derivat d’ella. Els nostres resultats han demostrat que el fenotip mucoide s’associa a una menor capacitat per alterar i creuar la barrera epitelial. P. aeruginosa altera la permeabilitat de l’epiteli gràcies a la reducció dels nivells d’una proteïna essencial en la unió de cèl·lules, ZO-1. Aquesta reducció te lloc mitjançant l’acció de les exotoxines bacterianes ExoS i ExoT i per l’activació del factor de transcripció cel·lular NF-kB induïda pel patogen. La mutació de mucA redueix l’expressió de les exotoxines i la capacitat del microorganisme per induir l’activació de NF-kB. Aquests dos fets, juntament amb la menor mobilitat que presenta el mutant deficient en mucA, contribueixen a la reduïda capacitat invasora que presenten les soques mucoides. En una segona part, s’ha investigat l’impacte de la trimetilació d’EF-Tu sobre la patogenicitat del microorganisme mitjançant l’anàlisi del proteoma global de la soca de laboratori PAO1 i la soca HM4, procedent d’una infecció crònica, els respectius mutants isogènics deficients en la metiltransferasa responsable de la modificació (EftM) i els corresponents mutants complementats. Els nostres resultats han demostrat que la modificació d’EF-Tu altera de forma molt discreta un nombre molt reduït de proteïnes que fins a la data no han estat implicades en la patogenicitat del microorganisme. En canvi, els resultats obtinguts en un model murí de pneumònia demostren que la deficiència d’EftM redueix la virulència de P. aeruginosa. Conclusions: La mutació de mucA redueix la capacitat invasora de P. aeruginosa, ja que afecta als mecanismes que el microorganisme utilitza per alterar la permeabilitat de la barrera epitelial; la reducció de la proteïna d’unió intercel·lular ZO-1 mitjançant l’acció de les exotoxines i la inducció de l’activació de NF-kB. Aquest fet podria determinar el confinament de les soques mucoides en el pulmó dels pacients amb fibrosis quística. L’impacte de la trimetilació d’EF-Tu sobre la patogenicitat de P. aeruginosa sembla residir únicament en la generació d’un domini estructural semblant a la fosforilcolina, que facilita la interacció del microorganisme amb les cèl·lules humanes.

[eng] Introduction: Pseudomonas aeruginosa is the main responsible for chronic infections in cystic fibrosis patients and currently accounts for the majority of the morbidity and mortality seen in the disease. In order to persist in the lung of these patients, this microorganism undergoes several characteristic adaptations including mutation of mucA and trimethylation of the elongation factor Tu (EF-Tu). Mutation of mucA confers a mucoid phenotype to P. aeruginosa, due to the exopolysaccharide alginate hyperproduction, and is associated with a poor prognosis of the disease. Trimethylation of EF-Tu, mediated by the methyltransferase EftM, results in an epitope that mimics phosphorylcholine which mediates the interaction with the host cells. In this work we have investigated the impact of both adaptations on P. aeruginosa pathogenicity. Research content: In the first part, we have investigated the effect of the mutation of mucA on the invasive capacity of the microorganism. We have analyzed the ability to alter and cross a polarized human respiratory epithelium using a collection of isolates, mucoid and nonmucoid, from both acute and chronic respiratory infections; a laboratory strain and the derived mucA deficient isogenic mutant. Our results have showed that mucoid phenotype is associated with a lower ability to alter and cross the epithelial barrier. We have demonstrated that P. aeruginosa alters the permeability of the epithelium due to the reduction of ZO-1 levels, a protein associated with the intercellular tight junctions. ZO-1 reduction is mediated by exotoxins ExoS and ExoT and by P. aeruginosa induced activation of NF-kB. MucA mutation reduced the expression of both exotoxins and the ability to induce the activation of NF-kB. These two facts, together with the lower mobility of the mucA deficient mutant contribute to the reduced invasive capacity exhibit by the mucoid strain. In the second part, we have investigated the effect of the modification of EF-Tu on the pathogenicity of P. aeruginosa through the analysis of the global proteome of the laboratory strain PAO1 and the clinical strain HM4, derived from a chronic infection, the deficient isogenic eftM mutants derived from both strains and the corresponding complemented mutants. Our results have showed that the modification of EF-Tu alters slightly the expression of a reduced number of proteins. To our knowledge, none of the altered proteins detected have been implicated in the virulence of this microorganism. However, the results obtained in a murine model of pneumonia show that the deficiency of EftM reduces the virulence of P. aeruginosa. Conclusions: Mutation of mucA reduces the invasiveness of P. aeruginosa because it impairs the strategies that this microorganism exploits to disrupt the permeability of the epithelial barrier; reduction of the intercellular tight junction protein ZO-1 mediated by the exotoxins and induction of NF-kB activation. The impact of the trimethylation of EF-TU on the pathogenicity of P. aeruginosa seems to rely exclusively on the generation of a structural epitope that mimics phosphorylcholine which facilitates the interaction with the host cell.