Estudio del cinamaldehído y el eugenol como compuestos potencialmente bioactivos en el control de la obesidad y alteraciones asociadas

Abstract

[spa] La obesidad y la diabetes mellitus afectan a más de un tercio de la población mundial actual y, si la tendencia continúa, para 2030 se estima que el 38% de la población adulta mundial tendrá sobrepeso y otro 20% será obeso. En un intento de mejorar los resultados de los tratamientos de la obesidad y enfermedades asociadas hay una tendencia emergente en la investigación científica actual, que busca nuevas moléculas que puedan usarse como biomoléculas funcionales para el control de la obesidad y sus comorbilidades. El clavo de olor y la canela se han utilizado tradicionalmente por sus propiedades para manejar numerosas condiciones de salud y como especias en la industria de alimentos, estas especias han sido descritas ampliamente por tener propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, y/o antidiabéticas. El cinamaldehído (CNA), es el compuesto mayoritario de la canela y el eugenol (EU) es el compuesto mayoritario del clavo de olor. En esta tesis doctoral se han seleccionado dos compuesto potencialmente bioactivos, cinamaldehído y eugenol, con el objetivo de estudiar su efecto in vitro e in vivo, de forma individual y de forma conjunta, para caracterizar los mecanismos moleculares de sus efectos en el control de la adiposidad, y un posible efecto sinérgico de estos dos compuestos. Nuestro primer objetivo ha sido caracterizar in vitro el efecto del eugenol y cinamaldehído y su combinación en la expresión de genes clave implicados en el metabolismo lipídico en el adipocitos maduro y durante la adipogénesis. Para ello se trataron los cultivos de preadipocitos de la línea 3T3-L1 durante todo el proceso de diferenciación y en etapa de adipocitos maduros con diferentes dosis de EU, CNA y EU+CNA durante 24 horas. Los resultados indican que el eugenol y cinamaldehído afectan la expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico en adipocitos maduros de la línea celular 3T3-L1. En concreto, el tratamiento con EU (400 μM) disminuye la expresión del ARNm de Fasn y Lipe y el tratamiento con CNA (400 μM) disminuye la expresión de Fasn y aumenta la expresión de Cpt1b en comparación con el tratamiento control. El tratamiento combinado EU+CNA tiene un efecto sinérgico en la inhibición dosis-respuesta de la expresión de los genes lipogénicos (Srebf1, Pparg, Fasn), sugiriendo un efecto antilipogénico de estos compuestos. Los compuestos bioactivos eugenol, cinamaldehído y su tratamiento combinado afectan la expresión de genes clave implicados en el metabolismo lipídico en adipocitos maduros, pero no afectan al proceso de diferenciación o adipogénesis. El segundo objetivo ha sido estudiar en ratas Wistar macho adultas la capacidad del eugenol y el cinamaldehído para contrarrestar el desarrollo de obesidad ante una dieta obesogénica. Para ello, estudiamos in vivo el efecto de la administración oral de EU, CNA y la combinación de ambos EU+CNA en ratas Wistar macho de 4 meses de edad alimentadas con una dieta obesogénica. Distribuimos los animales en cinco grupos experimentales: CONTROL (ratas alimentadas con una dieta estándar), WD (ratas alimentadas con dieta obesogénica comercial, rica en grasas y azúcares simples (dieta western diet)), WD+EU (ratas alimentadas con una dieta obesogénica comercial y que recibieron diariamente vía oral 40mg/kg/día de eugenol), WD+CNA (ratas alimentadas con una dieta obesogénica comercial y que recibieron diariamente vía oral 250mg/kg/día de cinamaldehído), WD+EU+CNA (ratas alimentadas con una dieta obesogénica comercial y que recibieron diariamente vía oral 40+250 mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído, respectivamente). El tratamiento se realizó durante 30 días. Se analizó diariamente la evolución del peso y la ingesta de alimento. Se tomaron medidas de la grasa corporal al inicio y al final del estudio. En el día 15 de experimentación se extrajeron muestras de sangre de la vena safena de los animales en condiciones de ayuno. Analizamos la expresión de genes de interés relacionados con el metabolismo lipídico y el tamaño de los adipocitos del tejido adiposo blanco retroperitoneal e inguinal. Hemos observado que el tratamiento con CNA parece ejercer un cierto efecto anorexigénico que podría explicar la menor ganancia de peso y grasa corporal de los animales. Además, la administración de CNA a ratas alimentadas con una dieta obesogénica reduce el tamaño de los adipocitos y mejora los niveles circulantes de insulina. Los animales del grupo WD+EU, pese a tener una ingesta calórica similar al grupo WD, presentaron un menor peso corporal al final del tratamiento comparado con el grupo WD. Los animales que recibieron el tratamiento combinado presentan efectos muy similares a los observados en animales tratados sólo con CNA, por lo que deducimos que los efectos observados del tratamiento combinado se deben principalmente a los efectos del CNA Por tanto, el cinamaldehído y el eugenol emergen como posibles compuestos bioactivos potenciales como terapia de control de la obesidad y alteraciones asociadas. La administración de cinamaldehído (250mg/kg/día) previene del incremento en el peso corporal y del aumento del porcentaje de grasa en animales alimentados con una dieta obesogénica. Además, el tamaño de los adipocitos en el tejido adiposo blanco retroperitoneal es menor en los que recibieron WD+CNA que en animales WD, y similar a los adipocitos de los animales del grupo control. Estos compuestos, particulamente el CNA, se muestran eficaces para contrarrestar el desarrollo de obesidad ante una dieta obesogénica.

[cat] L'obesitat i la diabetis mellitus afecten més d'un terç de la població mundial actual i, si aquesta tendència continua, s'estima que l’any 2030 el 38% de la població adulta tindrà sobrepès i un 20% serà obès. Per millorar els resultats dels tractaments de l'obesitat i malalties associades hi ha una tendència emergent en la recerca científica actual, que cerca noves molècules que puguin emprar-se com biomolècules funcionals per al control de l'obesitat i les seves comorbiditats. El clau d'olor i la canyella s'han utilitzat tradicionalment per les seves propietats relacionades amb la salut i com espècies a la indústria d'aliments. S’ha descrit àmpliament a la bibliografia científica que aquestes espècies poden tenir propietats antioxidants, antiinflamatòries, i/o antidiabètiques. El cinamaldehid (CNA), és el compost majoritari de la canyella i l'eugenol (EU) és el compost majoritari del clau d'olor. En aquesta tesi doctoral s'han seleccionat dos compostos potencialment bioactius, cinamaldehid i eugenol, amb l'objectiu d'estudiar el seu efecte in vitro i in vivo, de forma individual i de forma conjunta, per caracteritzar els mecanismes moleculars dels seus efectes en el control de l’adipositat, i per caracteritzar un possible efecte sinèrgic d'aquests dos compostos. El nostre primer objectiu ha estat caracteritzar in vitro l'efecte del cinamaldehid i de l'eugenol, i de la seva combinació en l'expressió de gens clau implicats en el metabolisme lipídic al adipòcits madur i durant l’adipogènesi. Per a això es van tractar els cultius de preadipòcits de la línia 3T3-L1 durant tot el procés de diferenciació i en etapa d'adipòcits madurs amb diferents dosis d'EU, CNA i EU+CNA durant 24 hores. Els resultats indiquen que l'eugenol i cinamaldehid afecten l'expressió de gens implicats en el metabolisme lipídic en adipòcits madurs de la línia cel·lular 3T3-L1. En concret, el tractament amb EU (400 μM) disminueix l'expressió de l'ARNm de Fasn i Lipe i el tractament amb CNA (400 μM) disminueix l'expressió de Fasn i augmenta l'expressió de Cpt1b en comparació amb el tractament control. El tractament combinat EU+CNA té un efecte sinèrgic en la inhibició dosi-resposta de l'expressió dels gens lipogènics (Srebf1, Pparg, Fasn), el que suggereix un efecte antilipogènic d'aquests compostos. L’eugenol, cinamaldehid i el seu tractament combinat afecten l'expressió de gens clau implicats en el metabolisme lipídic en adipòcits madurs, però no afecten el procés de diferenciació o adipogènesi El segon objectiu ha estat estudiar en rates Wistar mascle adultes la capacitat del cinamaldèhid i de l’eugenol per contrarestar el desenvolupament d'obesitat front d'una dieta obesogènica. Per a això, vam estudiar in vivo l'efecte de l'administració oral d'EU, CNA i la seva combinació EU+CNA en rates Wistar mascle de 4 mesos d'edat alimentades amb una dieta obesogènic. Els animals es distribuïren en cinc grups experimentals: CONTROL (rates alimentades amb una dieta estàndard), WD (rates alimentades amb dieta obesogènic comercial, rica en greixos i sucres simples (dieta western diet)), WD+EU (rates alimentades amb una dieta obesogènic comercial i que van rebre diàriament via oral 40 mg/kg/dia d’eugenol), WD+CNA (rates alimentades amb una dieta obesogènica comercial i que van rebre diàriament via oral 250mg/kg/dia de cinamaldehid), WD+EU+CNA (rates alimentades amb una dieta obesogènic comercial i que van rebre diàriament via oral 40+250 mg/kg/dia d’eugenol i cinamaldehid, respectivament). El tractament es va realitzar durant 30 dies. Es va analitzar diàriament l'evolució del pes i la ingesta d'aliment. Es van prendre mesures del greix corporal a l'inici i al final de l'estudi. Després de 15 dies d'experimentació es van extreure mostres de sang de la vena safena dels animals en condicions de dejuni. Analitzàrem l'expressió de gens d'interès relacionats amb el metabolisme lipídic i la mida dels adipòcits del teixit adipós blanc retroperitoneal i inguinal. Hem observat que el tractament amb CNA sembla exercir un cert efecte anorexigènic que podria explicar el menor guany de pes i greix corporal dels animals. A més, l'administració de CNA a rates alimentades amb una dieta obesogènic redueix la mida dels adipòcits i millora els nivells circulants d'insulina. Els animals del grup WD+EU, tot i tenir una ingesta calòrica similar al grup WD, van presentar un menor pes corporal al final del tractament comparat amb el grup WD. Els animals que van rebre el tractament combinat presenten efectes molt similars als observats en animals tractats només amb CNA, de manera que deduïm que els efectes observats en el grup que rebé el tractament combinat es deuen principalment a l'efecte del CNA Per tant, el cinamaldehid i l'eugenol emergeixen com a possibles compostos bioactius potencials com a teràpia de control de l'obesitat i alteracions associades. L'administració de cinamaldehid (250mg/kg/dia) prevé l'increment en el pes corporal i de l'augment del percentatge de greix en animals alimentats amb una dieta obesogènica. A més, la mida dels adipòcits en el teixit adipós blanc retroperitoneal és menor en els que van rebre WD+CNA que en animals WD, i similar als adipòcits dels animals del grup control. Aquests compostos, particularment el CNA, es mostren eficaces per contrarestar el desenvolupament d'obesitat davant d'una dieta obesogénica.

[eng] Obesity and diabetes mellitus affect more than a third of the world's current population and if the trend continues by 2030 it is estimated that 38% of the world's adult population will be overweight and another 20% will be obese. In an attempt to improve the results of treatments for obesity and associated diseases, there is an emerging trend in current scientific research, which seeks new molecules that can be used as functional bimolecular to control obesity and its comorbidities. Clove and cinnamon have traditionally been used for their properties to manage numerous health conditions as spices in the food industry, these spices have been widely described as having antioxidant, anti-inflammatory, and / or antidiabetic properties. Cinnamaldehyde (CNA) is the major compound of cinnamon and eugenol (EU) is the major compound of clove. In this doctoral thesis two potentially bioactive compounds cinnamaldehyde and eugenol have been selected with the aim of studying their effect in vitro and in vivo, individually to characterize the molecular mechanisms of their effects in the control of adiposity, also in combination to identify a possible synergistic effect of these two compounds. Our first objective has been to characterize in vitro the effect of cinnamaldehyde, eugenol and their combination in the expression of key genes involved in lipid metabolism in mature adipocytes and during adipogenesis. For this, pre-adipocyte cultures of line 3T3-L1 were treated during the whole process of differentiation and in stages of mature adipocytes with different doses of EU, CNA and EU + CNA during 24 h. The results indicate that eugenol and cinnamaldehyde affect the expression of genes involved in lipid metabolism in mature adipocytes of the 3T3-L1 cell line. In particular, the treatment with EU (400 μM) decreases the expression of Fasn and Lipe mRNA and the treatment with CNA (400 μM) decreases the expression of Fasn and increases the expression of Cpt1b compared to the control treatment. The combined treatment EU + CNA has a synergistic effect on the dose-response inhibition of the expression of lipogenic genes (Srebf1, Pparg, Fasn), suggesting an antilipogenic effect of these compounds. The bioactive compounds eugenol, cinnamaldehyde and its combined treatment affect the expression of key genes involved in lipid metabolism in mature adipocytes, but do not affect the process of differentiation or adipogenesis. The second objective has been to study in adult male Wistar rats, the capacity of cinnamaldehyde and eugenol to counteract the development of obesity in the face of an obesogenic diet. To this end, we studied in vivo the effect of oral administration of EU, CNA and the combination of both EU+CNA in 4-month-old male Wistar rats fed an obesogenic diet. We distributed the animals in five experimental groups: CONTROL (rats fed a standard diet), WD (rats fed commercial obesogenic diet, rich in fats and simple sugars (western diet)), WD+EU (rats fed a commercial obesogenic diet and received daily orally 40mg/kg/day of eugenol), WD+CNA (rats fed a commercial obesogenic diet and receiving orally 250mg/kg/day of cinnamaldehyde orally), WD+EU+CNA (rats fed a commercial obesogenic diet and received daily orally 40+250mg/kg/day of eugenol and cinnamaldehyde, respectively). The treatment lasted for 30 days. The evolution of weight and food intake was daily analyzed. Measurements of body fat were taken at the beginning and end of the study. On 15th day of experimentation, blood samples were taken from the saphenous vein of the animals under fasting conditions. We analyzed the expression of genes of interest related to lipid metabolism and the size of the adipocytes of the retroperitoneal and inguinal white adipose tissue. We have observed that the treatment with CNA seems to exert a certain anorexic effect that could explain the lower weight gain and body fat of the animals. In addition, the administration of CNA to rats fed an obesogenic diet reduces the size of adipocytes and improves circulating insulin levels. The animals of the WD+EU group, despite of having a caloric intake similar to the WD group, had a lower bodyweight at the end of the treatment compared to the WD group. The animals that received the combined treatment have very similar effects to those observed in animals treated only with CNA, so we conclude that the observed effects of the combined treatment are mainly due to the effects of the CNA. Therefore, eugenol and cinnamaldehyde emerge as possible bioactive compounds in the control therapy of obesity and associated disorders. The administration of cinnamaldehyde (250mg/kg/day) to animals fed with the western diet, prevents the increase in weight and increase in the percentage of fat associated with the intake of the obesogenic diet. In addition, the size of the adipocytes in the white retroperitoneal adipose tissue is smaller in those who receives WD+CNA than in western diet animals, and similar to the adipocytes of the animals of the control group. It has been shown that these compounds are effective in counteracting the development of obesity under an obesogenic diet