Study of potential mechanisms involved in fat mass-lowering effects of conjugated linoleic acid and calcium in mice by focusing on gut microbiota, bone remodelling and epigenetic marks

Abstract

[eng] Obesity is currently increasing at an epidemic rate and is associated with a wide array of co-morbidities, such as metabolic syndrome, cancer and heart disease, among others. One of the approaches in order to tackle this issue is the identification of dietary factors which could be able to counteract the development of obesity. Within this context, our laboratory has previously carried out studies to determine the potentially beneficial effects of conjugated linoleic acid (CLA) and calcium on body weight loss and fat mass accretion, and has shown that supplementation with either of these compounds in mice under diet-induced obesity causes decreased weight gain and lower adiposity levels. The aim of this Thesis has been to study potential mechanisms by which these two compounds could act, by focusing on ones that to our knowledge have not been previously analysed: 1) the effect on gut microbiota; 2) the relationship between bone and energy metabolism; 3) their potential effect on key tissues and organs involved in energy metabolism; and 4) DNA methylation of genes of interest within this context. In line with the previous work done in our lab, the study was carried out in an animal model of adult mice receiving a high-fat (HF) enriched with CLA or calcium. Results show that, on one hand, CLA stimulates the expression of gastric leptin and ghrelin and exerts a prebiotic action on specific bacteria in the caecum, particularly Bacteroidetes/ Prevotella and Akkermansia muciniphila. However, supplementation with this compound does not counteract the negative effect of a HF diet on Bifidobacterium spp., which was decreased in both groups. On the other hand, calcium has a similar effect, by also conferring a prebiotic effect, in particular on Bifidobacteirum spp. and Bacteroidetes/Prevotella, and by decreasing Clostridium spp. This modulation by calcium correlated with healthy metabolic parameters, suggesting that the effect observed on gut microbiota could partially explain the overall healthier metabolic profile of these animals. A faecal microbiota transplant, using faeces from calcium animals to animals receiving HF diet, revealed that a transplant alone is not able to confer the beneficial effects seen in the microbiota of animals from the calcium group. This suggests that calcium itself provides an adequate environment for the growth of the studied bacteria and without its presence such bacteria are not able to colonise the colon. Moreover, calcium supplementation contributes to the maintenance of bone mass, although effects are mainly seen when both CLA and calcium are co-supplemented, suggesting a beneficial effect of these two compounds on bone health in obesity treatment. A similar effect was observed when analysing the methylation profile of specific genes, which is significantly altered in a gene- and tissue-specific manner, in particular by calcium and cosupplemented with CLA. The changes observed in DNA methylation profile, induced by dietary supplementation, were mainly seen in those animals which presented an overall healthier metabolic profile, introducing the need to consider the potential of epigenetic modulation strategies for obesity management. Overall, this Thesis shows that a diet supplemented with calcium has beneficial effects on body weight and adiposity in mice, which could be mediated by the modulation of gut microbiota and the methylation profile of genes associated to lipid metabolism. In addition, combined treatment with CLA shows beneficial effects on bone mass and parameters associated with their formation.

[spa] En la actualidad, la prevalencia de la obesidad está creciendo de forma epidémica y global, asociada con una amplia gama de patologías, como el síndrome metabólico, el cáncer y las enfermedades coronarias, entre otras. Uno de los enfoques para hacer frente a este problema es la identificación de factores nutricionales que puedan ser relevantes para contrarrestar el desarrollo de la obesidad. Previamente, nuestro laboratorio ha realizado estudios para determinar los efectos potencialmente beneficiosos del ácido linoleico conjugado (CLA) y del calcio sobre la pérdida de peso y masa grasa corporal en ratones, y se ha visto que la suplementación con estos dos compuestos bajo una dieta obesogénica se acompaña de un menor aumento de peso y adiposidad. El objetivo de esta Tesis ha sido estudiar posibles mecanismos relacionados con la acción de estos dos compuestos, centrándose en elementos que no habían sido analizados anteriormente: 1) el efecto sobre la microbiota intestinal; 2) la relación entre el metabolismo óseo y energético; 3) su potencial efecto en los principales tejidos y órganos implicados en el metabolismo energético; y 4) la metilación del ADN en genes de interés. Siguiendo con la línea de investigación previamente iniciada en nuestro grupo, se trabajó en un modelo animal de ratones adultos a los que se suministró una dieta de alto contenido en grasa (HF) suplementada con CLA o calcio. Los resultados muestran que, por un lado, el CLA estimula la expresión de leptina y grelina en estómago y además ejerce una acción prebiótica en bacterias específicas en el ciego, en particular sobre las especies Bacteroidetes/Prevotella y Akkermansia muciniphila. Sin embargo, la suplementación con este compuesto no pudo contrarrestar el efecto negativo de una dieta HF sobre Bifidobacterium spp., disminuida en ambos grupos. Por otro lado, el calcio tiene un efecto similar, confiriendo también un efecto prebiótico, en particular sobre Bifidobacteirum spp. y Bacteroidetes/Prevotella, además de disminuir Clostridium spp. Esta modulación por el calcio se correlaciona con parámetros metabólicos beneficiosos, sugiriendo que el efecto prebiótico observado sobre la microbiota intestinal podría explicar en parte el perfil más saludable observado en estos animales. Un trasplante de bacterias de origen fecal, usando heces de animales que recibían la dieta enriquecida en calcio, a animales sometidos a una dieta HF, puso de manifiesto que el trasplante por sí solo no es capaz de conferir los efectos beneficiosos sobre la microbiota observados en animales con dieta suplementada en calcio. Esto indica que el calcio en sí mismo debe proporcionar un sustrato adecuado, posibilitando el efecto prebiótico sobre las bacterias estudiadas y que sin su presencia dichas bacterias no pueden colonizar adecuadamente el colon. Por otra parte, el calcio contribuye al mantenimiento de la masa ósea, aunque los efectos se observan principalmente cuando el CLA y el calcio se suplementan a la vez, indicando un efecto beneficioso de ambos compuestos sobre la salud ósea durante el tratamiento de la obesidad. Un efecto similar se observa también en el perfil de metilación, que fue significativamente alterado de forma específica al gen y al tejido estudiado, en particular por el calcio y en combinación con el CLA. El perfil de metilación del ADN inducido por los compuestos estudiados, en animales adultos y que presentaban un perfil metabólico más saludable, introduce la necesidad de considerar la potencial modulación epigenética en las estrategias para el control de la obesidad. En definitiva, esta Tesis pone de relieve que una dieta suplementada con calcio ejerce efectos beneficiosos sobre el peso corporal y la adiposidad en ratones, que vendría mediado por la modulación de la microbiota intestinal así como del perfil de metilación de genes asociados al metabolismo lipídico. Además, el tratamiento conjunto con CLA muestra efectos beneficiosos sobre la masa ósea y parámetros relacionados con su formación.

[cat] En l’actualitat, la prevalença de l’obesitat està augmentant de forma epidèmica i global, associada amb una àmplia gamma de patologies, com la síndrome metabòlica, el càncer i les malalties coronàries, entre d’altres. Una de les estratègies per a fer front a aquest problema és la identificació de factors nutricionals que puguin ser rellevants per a contrarestar el desenvolupament de la obesitat. Prèviament, el nostre laboratori ha realitzat estudis per a determinar els efectes potencialment beneficiosos de l’àcid linoleic conjugat (CLA) i del calci sobre la pèrdua de pes i de massa grassa corporal en ratolins, i s’ha observat que la suplementació amb aquests dos compostos sota una dieta alta en greix disminueix l’augment de pes i adipositat. L’objectiu d’aquesta Tesi ha estat estudiar possibles mecanismes relacionats amb l’acció d’aquests dos compostos, centrant-se en elements que fins ara no havien estat analitzats: 1) l’efecte sobre la microbiota intestinal; 2) la relació entre el metabolisme ossi i energètic; 3) el seu potencial efecte en els principals teixits i òrgans implicats en el metabolisme energètic; i 4) la metilació del ADN en gens d’interès. Seguint amb la línia prèviament iniciada en el nostre grup, l’estudi s’ha dut a terme en ratolins adults sota una dieta alta en greix (HF) i rebent una suplementació d’aquests dos compostos, el CLA i el calci. Els resultats mostren que, per una banda, el CLA estimula l’expressió de leptina i grelina a l’estómac i que exerceix una acció prebiòtica sobre bactèries de l’intestí, en particular sobre les espècies Bacteroidetes/Prevotella i Akkermansia muciniphila. Per altra banda, però, la suplementació amb aquest compost no va poder contrarestar l’efecte negatiu de la dieta HF sobre Bifidobacterium spp., que es trobava disminuïda en els dos grups. El calci va tenir un efecte similar, conferint també un efecte prebiòtic, en particular sobre Bifidobacteirum spp. i Bacteroidetes/Prevotella, a més a més de disminuir Clostridium spp. Aquesta modulació del calci es correlaciona amb paràmetres metabòlics beneficiosos, suggerint que l’efecte prebiòtic observat sobre la microbiota intestinal podria explicar, en part, el perfil més saludable observat en aquests animals. Un transplant de bactèries d’origen fecal, fent servir femtes d’animals rebent calci i transferint-les a animals que rebien una dieta HF, va posar de manifest que un transplant per si sol no es capaç de conferir els efectes beneficiosos sobre la microbiota observats en animals amb una dieta suplementada amb calci. Aquests resultats indiquen que el calci deu proporcionar un substrat adequat, possibilitant aquest efecte prebiòtic sobre les bactèries estudiades i que, sense la seva presència, aquestes no poden colonitzar adequadament el colon. D’altra banda, el calci contribueix al manteniment de la massa òssia, tot i que els efectes es van observar principalment quan el CLA i el calci es van suplementar a la vegada, indicant un efecte beneficiós dels dos compostos sobre la salut òssia en un context de pèrdua de pes. Un efecte similar s’observa en el perfil de metilació, que es trobava alterat de forma significativa i específica al gen i al teixit estudiat, en particular per la suplementació del calci i en combinació amb el CLA. El perfil de metilació induït per els compostos estudiats, en animals adults i que presenten un perfil metabòlic més saludable, apunta la necessitat de considerar la potencial modulació epigenètica en les estratègies per al control de la obesitat. En definitiva, aquesta Tesi posa de manifest que una dieta suplementada amb calci exerceix efectes beneficiosos sobre el pes corporal i l’adipositat en ratolins, que vindrien mediats per una modulació de la microbiota intestinal així com del perfil de metilació de gens associats al metabolisme lipídic. A més a més, el tractament conjunt amb CLA mostra efectes beneficiosos sobre la massa òssia i sobre paràmetres relacionats amb la seva formació.