Filogenia y evolución de las poblaciones ambientales y clínicas de Pseudomonas stutzeri y otras especies relacionadas

Abstract

[eng] Pseudomonas stutzeri is a widely distributed species with very high genetic diversity and metabolic capacities, occupying many diverse ecological niches. In the first chapter, the identification of Pseudomonas stutzeri clinical isolates through conventional phenotypic methods was compared with identification through partial rpoD gene sequencing. We observed that commercial phenotypic systems easily confuse P. stutzeri with other Pseudomonas species. We also demonstrated that most of the clinical strains of P. stutzeri herein studied (79%) belonged to genomovar 1 of the species. We propose the use of partial rpoD gene sequence analysis as a complementary molecular tool for the precise routine identification and genomovar assignation of P. stutzeri clinical isolates, as well as for typing and epidemiological studies. In the second chapter, a collection of 229 P. stutzeri strains isolated from different habitats and geographical locations has been characterized phylogenetically, by MLSA, and phenotypically by WC-MALDI-TOF MS. Both methods showed coherence in strain grouping; 226 strains were allocated in the 18 genomovars known presently. The remaining three strains are proposed as references for three novel genomovars in the species. The correlation and usefulness of sequence-based phylogenetic analysis and whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry, which are essential for studies in microbial ecology, is discussed for the differentiation of P. stutzeri populations. Multilocus sequence analysis (MLSA) is one of the most accepted methods for the phylogenetic assignation of Pseudomonas strains to their corresponding species. Updated databases are essential for correct bacterial identification and the number of Pseudomonas species is increasing continuously. Novel species have been described since the publication of the last comprehensive MLSA phylogenetic study based on the sequences of the 16S rDNA, gyrB, rpoB and rpoD genes. Therefore, in the third chapter an update of the sequence database is presented, together with the analysis of the phylogeny of the genus Pseudomonas. Whole-cell matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight (WC-MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) analysis has been applied very recently to the identification of bacteria and is considered a fast and reliable method. A total of 133 type strains of the recognized species and subspecies in the genus Pseudomonas, together with other representative strains, were analyzed using this new technique, and the congruence between the WC-MALDI-TOF MS and MLSA techniques was assessed for the discrimination and correct species identification of the strains. The utility of both methods in the identification of environmental and clinical strains is discussed. Chapter four describes how Pseudomonas and related species can act as environmental reservoir for antibiotic resistance genes. A total of 10 metallo--lactamase-producing isolates of six different species, including Brevundimonas diminuta (n=3), Rhizobium radiobacter (n=2), Pseudomonas monteilii (n= 1), Pseudomonas aeruginosa (n =2), Ochrobactrum anthropi (n = 1), and Enterobacter ludwigii (n = 1), were detected in the sewage water from Son Llàtzer Hospital in Mallorca, Spain. The presence of blaVIM-13 associated with a Tn1721-class 1 integron structure was detected in all but one of the isolates (E. ludwigii, which produced VIM-2), and in two of them (R. radiobacter), this structure was located on a plasmid, suggesting that environmental bacteria represent a reservoir for the dissemination of clinically relevant metallo--lactamase genes. Chapter five describes the taxonomic characterization of the Brevundimonas isolates (formerly Pseudomonas) described in chapter four. Three ceftazidime-resistant strains isolated from the sewage water of a municipal hospital in Palma de Mallorca, Spain, were analysed phenotypically and genotypically to clarify their taxonomic positions. Sequence determinations and phylogenetic analyses of the 16S rRNA genes indicated that strains CS20.3T, CS39 and CS41 were affiliated with the species of the alphaproteobacterial genus Brevundimonas, most closely related to B. bullata, B. diminuta, B. naejangsanensis and B. terrae. Additional sequences analyses of the ITS1 region of the rRNA operon and the genes for the housekeeping enzymes DNA gyrase β-subunit and RNA polymerase β-subunit, genomic DNA-DNA hybridisation similarities, cell fatty acid profiles and physiological and biochemical characterizations supported the recognition of CS20.3T (CCUG 58127T = CECT 7729T) as a distinct and novel species, for which the name Brevundimonas faecalis sp. nov. is proposed. Strains CS39 and CS41 were ascribed to the species B. diminuta.

[spa] Pseudomonas stutzeri es una especie que ocupa diversos nichos ecológicos y destaca por su gran diversidad genética y capacidades metabólicas. En el primer capítulo, se compara la utilización de métodos fenotípicos convencionales con el análisis de la secuencia parcial del gen rpoD para la identificación de aislamientos clínicos de Pseudomonas stutzeri. Observamos que los sistemas fenotípicos comerciales confunden fácilmente a P. stutzeri con otras especies de Pseudomonas. Comprobamos además, que la mayoría de las cepas clínicas de P. stutzeri de este estudio (79%) pertenecían a la genomovar 1 de la especie. Se propone el uso del análisis de la secuencia parcial del gen rpoD como una herramienta molecular precisa para la identificación rutinaria y la asignación a genomovar de los aislamientos clínicos de P. stutzeri, En el segundo capítulo, una colección de 229 cepas de P. stutzeri aisladas de diferentes hábitats y localizaciones geográficas se caracterizaron filogenéticamente, mediante el análisis de de secuencias multilocus, y fenotípicamente por espectrometría de masas a partir de colonias (Whole-cell Matrix-assisted Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, WC-MALDI-TOF MS). La agrupación de las cepas fue congruente en ambos métodos; 226 cepas fueron asignadas a las 18 genomovares conocidas actualmente. Las tres cepas restantes se proponen como cepas de referencia para tres nuevas genomovares de la especie. En este capítulo se analiza la correlación y la utilidad del análisis filogenético basado en el análisis de secuencias multilocus y de la espectrometría de masas (WC-MALDI-TOF MS), para el estudio de poblaciones de P. stutzeri. El análisis de secuencias multilocus (MLSA) es uno de los métodos más aceptados para la asignación filogenética de cepas de Pseudomonas a sus correspondientes especies. Dado que el número de especies de Pseudomonas está aumentando continuamente, es esencial mantener las bases de datos de secuencias actualizadas, para asegurar así una correcta identificación bacteriana. Desde la publicación del último estudio filogenético integral basado en las secuencias de los genes 16S rDNA, gyrB, rpoB y rpoD se han descrito nuevas especies. Por lo tanto, en el tercer capítulo se presenta una actualización de la base de datos de secuencias, junto con el análisis de la filogenia del género Pseudomonas. La espectrometría de masas (WC-MALDI-TOF) se ha aplicado recientemente a la identificación de bacterias y se considera un método rápido y fiable. Un total de 133 cepas tipo de las especies y subespecies reconocidas del género Pseudomonas, junto con otras representantes, se analizaron mediante esta nueva técnica. Luego, se evaluó la congruencia entre las técnicas MLSA y WC-MALDI-TOF MS para una discriminación e identificación correcta de las especies del género. Se discute la utilidad de ambos métodos en la identificación de cepas ambientales y clínicas. El capítulo cuatro describe cómo Pseudomonas y otras especies relacionadas pueden actuar como reservorio ambiental de genes de resistencia a antibióticos. Se investigó

una salida de aguas residuales del Hospital Son Llàtzer (Mallorca, España) y se encontraron un total de 10 aislamientos productores de metalo-β-lactamasa pertenecientes a seis especies diferentes, incluyendo Brevundimonas diminuta (n = 3), Rhizobium radiobacter (n = 2), Pseudomonas monteilii (n = 1), Pseudomonas aeruginosa (n = 2), Ochrobactrum anthropi (n = 1), y Enterobacter ludwigii (n = 1). Se detectó la presencia de un integrón de clase 1 asociado al trasposon Tn1721 que contiene el gen de resistencia blaVIM-13 en todos menos uno de los aislamientos (E. ludwigii, que produjo blaVIM-2), y en dos de ellos (R. radiobacter), esta estructura estaba ubicada en un plásmido, lo que sugiere que las bacterias ambientales representan un reservorio para la difusión de genes metalo-β-lactamasa clínicamente relevantes. El capítulo cinco describe la caracterización taxonómica de los aislamientos de Brevundimonas (anteriormente Pseudomonas) descritos en el capítulo cuatro. Tres cepas resistentes a ceftazidima aisladas de las aguas residuales del Hospital Son Llatzer de Palma de Mallorca, España, se analizaron fenotípica y genotípicamente para aclarar sus posiciones taxonómicas. El análisis filogenético del gen 16S rRNA indicaba que los aislamientos CS20.3T, CS39 y CS41 estaban afiliados al género Brevundimonas en la clase Alphaproteobacteria, más estrechamente relacionados con B. bullata, B. diminuta, B. naejangsanensis y B. terrae. El análisis de las secuencias del ITS1 del operón rRNA y los genes para los enzimas ADN girasa subunidad β (gyrB) y ARN polimerasa subunidad β (rpoB), la hibridación ADN-ADN, los perfiles de ácidos grasos celulares y la caracterización fisiológica y bioquímica, justifican el reconocimiento del aislamiento CS20.3T (CCUG 58127T = CECT 7729T) como una especie distinta y nueva, para la cual se propone el nombre Brevundimonas faecalis. Los aislamientos CS39 y CS41 se adscribieron a la especie B. diminuta.

[cat] Pseudomonas stutzeri és una espècie que ocupa diversos nínxols ecològics i destaca per la seva gran diversitat genètica i capacitats metabòliques. En el primer capítol, es compara la utilització de mètodes fenotípics convencionals amb l'anàlisi de la seqüència parcial del gen rpoD per a la identificació d'aïllaments clínics de Pseudomonas stutzeri. Observem que els sistemes fenotípics comercials confonen fàcilment a P. stutzeri amb altres espècies de Pseudomonas. Comprovem a més, que la majoria de les soques clíniques de P. stutzeri d'aquest estudi (79%) pertanyien a la genomovar 1 de l'espècie. Es proposa l'ús de l'anàlisi de la seqüència parcial del gen rpoD com una eina molecular precisa per a la identificació rutinària i l'assignació a genomovar dels aïllaments clínics de P. stutzeri. En el segon capítol, una col·lecció de 229 soques de P. stutzeri aïllades de diferents hàbitats i localitzacions geogràfiques es van caracteritzar filogenèticament, mitjançant l’anàlisi de seqüències multilocus (MLSA), i fenotípicament per espectrometria de masses a partir de colònies (Whole-Cell Matrix-Assisted Laser-Desorption/Ionization Time-Of Flight Mass Spectrometry,WC-MALDI-TOF MS). L'agrupació de les soques va ser congruent en tots dos mètodes; 226 soques van ser assignades a les 18 genomovars conegudes actualment. Les tres soques restants es proposen com a soques de referència per a tres noves genomovars de l'espècie. En aquest capítol s'analitza la correlació i la utilitat de l'anàlisi filogenètica basada en l'anàlisi de seqüències multilocus i de l'espectrometria de masses (WC-MALDI-TOF MS), per a l'estudi de poblacions de P. stutzeri. L'anàlisi de seqüències multilocus (MLSA) és un dels mètodes més acceptats per a l'assignació filogenètica de soques de Pseudomonas a les seves corresponents espècies. Atès que el nombre d'espècies de Pseudomonas està augmentant contínuament, és essencial mantenir les bases de dades de seqüències actualitzades, per assegurar així una correcta identificació bacteriana. Des de la publicació del darrer estudi filogenètic integral basat en les seqüències dels gens 16S rDNA, gyrB, rpoB i rpoD s'han descrit noves espècies. Per tant, en el tercer capítol es presenta una actualització de la base de dades de seqüències, juntament amb l'anàlisi de la filogènia del gènere Pseudomonas. L'espectrometria de masses (WC-MALDI-TOF) s'ha aplicat recentment a la identificació de bacteris i es considera un mètode ràpid i fiable. Un total de 133 soques tipus de les espècies i subespècies reconegudes del gènere Pseudomonas, juntament amb altres representants, es van analitzar mitjançant aquesta nova tècnica. Després, es va avaluar la congruència entre les tècniques MLSA i WC-MALDI-TOF MS per a una discriminació i identificació correcta de les espècies del gènere. Es discuteix la utilitat de tots dos mètodes en la identificació d’ aïllaments ambientals i clínics. El capítol quatre descriu com Pseudomonas i altres espècies relacionades poden actuar com reservori ambiental de gens de resistència a antibiòtics. Es va estudiar una sortida d'aigües residuals de l'Hospital Són Llàtzer (Mallorca, Espanya) i es van trobar un total

de 10 aïllaments productors de metalo--lactamasa pertanyents a sis espècies diferents, incloent Brevundimonas diminuta (n = 3), Rhizobium radiobacter (n = 2), Pseudomonas monteilii (n = 1), Pseudomonas aeruginosa (n = 2), Ochrobactrum anthropi (n = 1), i Enterobacter ludwigii (n = 1). Es va detectar la presència d'un integrón de classe 1 associat al trasposó Tn1721 que conté el gen de resistència blaVIM-13 en tots menys un dels aïllaments (E. ludwigii, que va produir blaVIM-2), i en dos d'ells (R. radiobacter), aquesta estructura estava situada en un plasmidi, la qual cosa suggereix que els bacteris ambientals representen un reservori per a la difusió de gens metalo--lactamasa clínicament rellevants. El capítol cinc descriu la caracterització taxonòmica dels aïllaments de Brevundimonas (anteriorment Pseudomonas) descrits en el capítol quatre. Tres soques resistents a ceftazidima aïllades de les aigües residuals de l'Hospital Són Llàtzer de Palma de Mallorca, Espanya, es van analitzar fenotípica i genotípicament per aclarir les seves posicions taxonòmiques. L'anàlisi filogenètica del gen 16S rRNA indicava que els aïllaments CS20.3T, CS39 i CS41 estaven afiliats al gènere Brevundimonas dels Alfaproteobacteris, més estretament relacionats amb B. bullata, B. diminuta, B. naejangsanensis i B. terrae. L'anàlisi de les seqüències de l’ITS1 de l'operó rRNA i els gens per als enzims ADN girasasubunitat gyrBi ARN polimerasasubunitat rpoB), la hibridació ADN-ADN, els perfils d'àcids grassos cel·lulars i la caracterització fisiològica i bioquímica, justifiquen el reconeixement de l'aïllament CS20.3T (CCUG 58127T = CECT 7729T) com una espècie diferent, per la qual es proposa el nom Brevundimonas faecalis. Els aïllaments CS39 i CS41 es van adscriure a l'espècie B. diminuta.