Improving osseointegration of titanium implants by a novel bioactive coating with UV-irradiated 7-dehydrocholesterol

Abstract

[eng] Current implant research aims at producing innovative bioactive surfaces to restore function in compromised skeletal structures. Surface modification of titanium (Ti) implants aims for a better biological response to the material to improve osseointegration. Increasing evidences highlight the essential role of vitamin D in bone regeneration and the profound negative effects of its insufficiency on implant osseointegration. Indeed, vitamin D deficiency leads to bone resorption, osteoporosis and reduced mineralization. Unfortunately, there is a high prevalence of vitamin D deficiency across all age groups in worldwide populations, what is due to inadequate dietary intake and insufficient exposure to sunlight. Calcitriol (1,25(OH)2D3), the biologically active form of vitamin D3, is produced by a hydroxylation cascade, which is preceded by a photochemical activation. It starts when 7- dehydrocholesterol (7-DHC) is exposed in the skin to UVB irradiation, involving the conversion into previtamin D3 (preD3). Afterwards, this metabolite is transformed into cholecalciferol (D3) and subsequently hydroxylated once in the liver and once in the kidneys to the end product. In this thesis, we demonstrated for the first time that the vitamin D precursor, 7-DHC, can be used to locally produce active vitamin D by osteoblastic cells and enhance their differentiation, when 7-DHC is coated on polystyrene surfaces and UV-irradiated before the cell culture. In addition, we proved the feasibility of using UV-irradiated 7-DHC to locally produce preD3 at the surface of Ti implants, which entails an increased osteoblast differentiation in vitro. Further, the biological potential of the present surface modification was confirmed in primary cultures of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs), which were promoted to differentiate towards the osteogenic lineage. Since 7-DHC is very labile to free radical oxidation, we proved the antioxidant properties of α- tocopherol (VitE) on preserving its stability. Furthermore, we improved the isomerization of preD3 to D3 on the Ti surface by adding an incubation of the coating at 23ºC for 48 hours after UV irradiation. Thus, UV-irradiated 7-DHC:VitE coated implants were tested in the murine preosteoclastic cell line RAW264.7 and further, in human gingival fibroblasts (HGFs). Interestingly, the bioactive coating inhibited osteoclastogenesis in vitro. Moreover, HGFs positively responded to these modified implants; the coating showed a positive action in the inflammatory response and in the ECM maturation/breakdown. Finally, an animal study verified its biological potential in vivo, the coating promoted the gene expression of the late bone formation marker osteocalcin (OC) in the peri-implant bone and increased ALP activity in the wound fluid. Additionally, the composition and bioactivity of the coating was maintained after 12 weeks when stored at 4ºC avoiding light, oxygen and moisture. All in all, results from this thesis demonstrate that UV-activated 7-DHC:VitE coated Ti implants promote differentiation of cells involved in hard and soft tissues, indicating a better peri-implant integration. Thus, this novel bioactive coating may be considered as a new approach for dental implant therapies.

[spa] La investigación actual sobre implantes tiene como objetivo producir superficies bioactivas innovadoras que restauren la función en estructuras esqueléticas comprometidas. La modificación de la superficie de implantes de titanio (Ti) pretende mejorar la respuesta biológica de los tejidos periimplantarios y favorecer la osteointegración. Cada vez hay más evidencias que destacan el papel esencial de la vitamina D en la regeneración ósea y los efectos negativos que tiene su insuficiencia en la osteointegración del implante. De hecho, la deficiencia de vitamina D conlleva reabsorción ósea, osteoporosis y menor mineralización. Desafortunadamente, existe una gran prevalencia de deficiencia de vitamina D en todas las edades a nivel mundial, debido a una dieta inadecuada e insuficiente exposición solar. El calcitriol (1,25(OH)2D3), la forma biológicamente activa de la vitamina D3, se produce por una cascada de hidroxilaciones, precedida por una activación fotoquímica. Comienza cuando el 7- dehidrocolesterol (7-DHC) se expone a la radiación UVB en la piel, convirtiéndose en previtamina D3 (preD3). Posteriormente, éste se transforma en colecalciferol (D3) y se hidroxila primero en el hígado y luego en los riñones hasta formar el producto final. En esta tesis, demostramos por primera vez que el precursor de la vitamina D, el 7-DHC, puede utilizarse para producir localmente vitamina D activa en células osteoblásticas e incrementar su diferenciación, cuando se recubren superficies de poliestireno con 7-DHC y se irradian con UV antes del cultivo celular. Además, comprobamos la posibilidad de usar 7-DHC irradiado con UV para producir preD3 en la superficie de implantes de Ti, lo que incrementa la diferenciación de osteoblastos in vitro. Posteriormente, el potencial biológico de esta modificación fue confirmado en cultivos primarios de células madre mesenquimales de cordón umbilical humano (hUC-MSCs), que fueron inducidas hacia el linaje osteogénico. Puesto que el 7-DHC es muy lábil a la oxidación por radicales libres, comprobamos las propiedades antioxidantes del α-tocoferol (VitE) en la preservación de su estabilidad. Además, mejoramos la isomerización de preD3 a D3 en la superficie de Ti al incubar el recubrimiento a 23ºC durante 48 horas tras la irradiación con UV. Estos implantes se testaron en la línea celular preosteoclástica murina RAW264.7, y en fibroblastos gingivales humanos (HGFs). Curiosamente, el recubrimiento bioactivo inhibió la osteoclastogénesis mientras que mostró una acción positiva en la respuesta inflamatoria y en la maduración/descomposición de la matriz extracelular en HGFs. Finalmente, un estudio animal verificó su potencial biológico in vivo, el recubrimiento incrementó la expresión génica del marcador tardío de formación ósea, osteocalcina (OC), en el hueso periimplantario y la actividad ALP en el fluido de la herida. Además, se comprobó que la composición y la bioactividad del recubrimiento se mantienen después de ser almacenados hasta 12 semanas a 4ºC, evitando la luz, el oxígeno y la humedad. En conjunto, los resultados de esta tesis demuestran que los implantes de Ti recubiertos con 7-DHC y VitE, e irradiados con UV, promueven la diferenciación de células pertenecientes al tejido duro y blando, indicando una mejor integración. De este modo, este novedoso recubrimiento bioactivo podría ser considerado como una nueva estrategia para terapias con implantes dentales.