B12-Riboswitch from Klebsiella pneumoniae as target for new antibiotics. Interaction study with natural and synthetic adenosylcobalamin derivatives

Abstract

[eng] Today is known that RNA does more functions than previously thought. Riboswitches are RNA molecules situated in the 5’-UTR (untranslated region), which are able to regulate gene expression via changing the RNA conformation upon interaction with a specific metabolite. These molecules have been postulated as good antibiotic targets as they regulate crucial metabolic pathways. Riboswitches consist of two domains; the aptamer where the metabolite is bound and the expression platform, which is the part that finally causes the gene expression regulation. The most common regulation mechanisms used are the transcription termination and the translation inhibition. A presumable btuB riboswitch sequence has been bioinformatically found in the genome of Klebsiella pneumoniae and has been proposed as a B12 riboswitch candidate. In our study, in-line probing experiments have been performed in order to validate the sequence as a riboswitch. A RNA conformational change has been observed in the RNA sequence upon interaction with AdoCbl. In the gene-on conformation, the ribosome binding site (RBS) is free and the btuB gene can be expressed. In contrast, after the metabolite interaction, the RNA is shifted to the geneoff conformation in which the RBS is masked in a base paired region. This fact proves the sequence as a riboswitch and suggests a translation inhibition mechanism. Then, thermodynamic parameters have been recorded using the isothermal titration calorimetry (ITC) experiments. Two different constructs were used: MB01 which contain the aptamer (214 nt.) and JP01 carrying both the aptamer and the expression platform (243 nt.). Titrations using AdoCbl as titrant were performed for both constructs at different temperatures ranging from 15 °C to 30 °C. Taking the results together we could say that the RNA-AdoCbl interaction is exothermic and follows a 1:1 stoichiometry. The enthalpy obtained at 25 °C is -119±3 kJ/mol for JP01 and -122.7±0.9 kJ/mol for MB01. These enthalpy values are in consonance with a sum of several weak interactions such as H-bond and π staking. The KD values for MB01 (770±90 nM at 25 °C) are higher than those obtained for JP01 (530±50 mM at 25 °C) in the entire temperature range. Thus, we can conclude that the presence of the expression platform in JP01 stabilizes the interaction of the btuB riboswitch with the AdoCbl. The inhibition translation mechanism was also proved by coupling the riboswitch to a red fluorescent protein (mCherry). The protein synthesis was inhibited after increasing amounts of AdoCbl were added to the culture media. Recently, there is a growing research interest in ligand analogues that are tested for antibiotic potential through riboswitch inhibition. With the aim to synthetize an antivitamin of Cbl, a culture of Allocromation vinosum has been anaerobically grown in a deficient cobalt medium. In these conditions, these purple sulphur bacteria are able to synthetize descobaltocobalamins and their derivatives. After cultivating 900 l of bacteria and collecting their cell pellet, we have been able to extract and purify 4mg of descobaltocobalamin and 2 mg of descobaltocobyric acid.

[cat] Avui en dia es sabut que l’ARN pot fer més funcions de les que inicialment li eren assignades. Els ribocommutadors són molècules d’ARN situades a la regió no traduïda de l’extrem 5’ (5’-UTR). Aquestes molècules, després d’interaccionar amb el seu metabòlit específic provoquen un canvi conformacional que és el responsable de la regulació génica. Els ribocommutadors s’han postulat com bones dianes per antibiòtics ja que regulen rutes metabòliques crucials. Els ribocommutadors contenen dos dominis, l’aptamer, que és el lloc d’unió del metabòlit, i la plataforma d’expressió, que és la part responsable de la regulació. Els mecanismes de regulació més comuns són la terminació de la transcripció i la inhibició de la traducció. Un presumible btuB ribocommutador ha estat identificat bionformàticament al genoma de Klebsiella pneumoniae i postulat com a ribocommutador de B12. Al nostre estudi, s’han realitzat experiments d’in-line probing per tal de validar la seqüencia com a ribocommutador. Un canvi conformacional a l’ARN ha estat detectat després de la interacció del ribocommutador amb el coenzim B12. An la conformació de gen-on, la zona d’unió amb el ribosoma (RBS) està lliure i el gen btuB pot esser expressat. Per contra, després de l’interacció amb el metabòlit, la conformació del ARN passa a ser gen-off, on la RBS forma part d’una regió d’aparellament de bases que impedeix l’accés al ribosoma. Aquests fets proven que aquesta seqüència és un ribocommutador de B12 i suggereix que el mecanisme de regulació és per inhibició de la traducció. Per altra banda, els paràmetres termodinàmics han estat calculats mitjançant valoracions de calorimetria isoterma (ITC). Per a aquest experiment es van usar dues seqüències diferents: MB01 que conté només l’aptamer (214 nt.) i la seqüència JP01 que conté l’aptamer i la plataforma d’expressió (246 nt.). A les valoracions calorimètriques s’ha usat AdoCbl com a valorant i s’han fet mesures en un rang de temperatures d’entre 15 °C a 30 °C per a les dues seqüències. Amb els resultats obtinguts es pot dir que la interacció entre l’ARN i AdoCbl és exotèrmica i segueix una estequiometria 1:1. L’entalpia de la interacció a 25 °C és de -119±3 kJ/mol per JP01 i de -122,7±0,9 kJ/mol per MB01. Aquests valors d’entalpia estan d’acord amb que la interacció és el resultat de la suma d’interaccions febles de tipus enllaç d’hidrogen o d’apilament. Els valors de KD obtinguts per MB01 (770±90 nM a 25 °C) són sempre més elevats que per JP01 (530±50 mM a 25 °C) a tot l’interval de temperatures. Per tant, es pot arribar a la conclusió que la plataforma d’expressió present a la seqüència JP01 té alguna funció en l’estabilització de la interacció del btuB riboswitch amb AdoCbl. El mecanisme de regulació per inhibició de la traducció ha estat validat fent un acoblament del ribocommutador amb una proteïna fluorescent vermella (mCherry), ja que la síntesi de la proteïna fluorescent s’inhibeix quan s’incrementa la concentració de cobalamina al medi de cultiu. Recentment, la recerca en el camp s’ha centrat en la modificació dels metabòlits que regulen els ribocommutadors, ja que s’han postulat com possibles antibiòtics degut a la inhibició de la funció dels ribocommutadors. Amb el propòsit de sintetitzar una antivitamina de cobalamina, s’ha fet créixer un cultiu d’Allocromatium vinoum en condicions anaeròbiques i de dèficit de cobalt. En aquestes condicions, aquests bacteris sintetitzen descobaltocobalamines i els seus derivats. Després de fer créixer 900 l de cultiu i recollir les pellets de cèl·lules, hem estat capaços d’extreure i purificar 4 mg de descobaltocobalamina i 2 mg d’àcid descobaltocobíric

[spa] Hoy dia es bien sabido que el ARN lleva a cabo más funciones que las que inicialmente se le asignaron. Los riboswitches son moléculas de ARN situadas en la región no traducida del extremo 5’ (5’-UTR). Dichas moléculas, después de interaccionar con su metabolito específico, provocan un cambio conformacional que es el responsable final de la regulación génica y, por ello, han sido postulados como buenas dianas para antibióticos, ya que regulan rutas metabólicas essenciales. Los riboswitches contienen dos dominios, el aptámero, donde se une el metabolito y la plataforma de expresión responsable de la regulación. Los mecanismos de regulación más comunes son la terminación de la transcripción y la inhibición de la traducción. Un presumible btuB riboswitch ha sido bioinformáticamente identificado en el genoma de Klebsiella pneumoniae y postulado como riboswitch de B12. En nuestro estudio, se han realizado experimentos de in-line probing para validar la secuencia como riboswitch. Un cambio conformacional del RNA ha sido detectado después de la interacción entre el riboswitch con AdoCbl. En la conformación gen-on, la zona de unión con el ribosoma (RBS) está libre y el gen btuB puede ser expresado. En cambio, después de la interacción con el metabolito, la conformación del ARN pasa a ser gen-off en la que el RBS forma parte de una región de apareamiento de bases que impide el acceso al ribosoma. Estos echos prueban que esta sequencia es un riboswitch de B12 y sugiere un mecanismo de regulación por inhibición de la traducción. Por otra parte, los parámetros termodinámicos han sido calculados mediante valoraciones calorimétricas isotermas (ITC). Dos secuencias diferentes han sido usadas: MB01 que continene el aptámero (214 nt.) y la secuencia JP01 que contiene el aptámero y la plataforma de expresión (246 nt.) En las valoraciones calorimétricas se ha usado la AdoCbl como valorante y se han realizado diferentes medidas entre 15 °C y 30 °C para ambas secuencias. Con los resultados obtenidos se puede decir que la interacción entre el ARN y la AdoCbl es exotérmica y que sigue una estequiometria 1:1. La entalpía de la interacción a 25 °C es de -119±3 kJ/mol para JP01 y de -122,7±0,9 kJ/mol para MB01. Estos valores de entalpía concuerdan con el hecho de que la interacción se produce a través de la suma de interacciones débiles, como el enlace de hidrógeno o el apilamiento. Los valores de KD obtenidos para MB01 (770±90 nM a 25 °C) son siempre mayores que los de JP01 (530±50 mM a 25 °C) en todo el intervalo de temperatures. Por tanto, se puede llegar a la conclusión de que la plataforma de expressión presente en la secuencia JP01 tiene alguna función en la estabilización de la interacción del btuB riboswitch con AdoCbl. El mecanismo de regulación por inhibición de la traducción ha sido validado acoplando el riboswitch a una proteína roja fluorescente (mCherry) y, de echo, la síntesis de la proteína fluorecente se inhibe cuando se incrementa la concentración de cobalamina en el medio de cultivo. Recientemente, la investigación en el campo se ha centrado en la modificación de los metabolitos que regulan los riboswitches, ya que se han postulado como posibles antibióticos debido a la inhibición de la función del riboswitch. Con el propósito de sintetitzar una antivitamina de cobalamina, un cultivo de Allocromatium vinoum se ha hecho crecer en condiciones anaeróbicas y de décifit de cobalto. En estas condiciones, estas bacterias sintetizan descobaltocobalaminas y sus derivados. Después de cultivar 900 l de cultivo y recoger las pellets de las células, hemos sido capaces de extraer y purificar 4 mg de descobaltocobalamina y 2 mg de ácido descobaltocobírico.