Novel bioavailability tests for risk assessment of organic emerging contaminants in environmental samples and food commodities: a holistic approach

Abstract

[eng] Exposure to the increasing occurrence of emerging pollutants in the environment is a topic of major concern. These pollutants do not only cause a serious environmental impact at all levels of the food chain, but they are key contributing along with other genetic and socioeconomic parameters to most chronic diseases. For the risk assessment of contaminants of emerging concern on organisms, liposomes, as biological membrane surrogates, were employed in this work. In fact, the role of lipids in membrane homeostasis gains steadily relevance, because there is an increasing knowledge on how any alteration can disturb membrane physical-chemical properties thereby affecting several cellular functions. The main aim of this thesis is to determine direct or indirect effects caused by a selection of emerging contaminants, available in pharmaceutical and personal care products, in several membrane properties, such as phospholipid order and packing, fluidity and hydration. Membranotropic effects as well as the most probable location and interaction of contaminants with the lipid bilayer were studied in a holistic approach through experimental and computational techniques in order to obtain a global view and avoid misleading interpretations. The idea of assessing the actual effect of contaminant species on the structure of liposomes led us to the design of a fully automated flow method that featured real-time acquisition of fluorescence readouts, data processing and feedback in a fully unsupervised mode with a high degree of reproducibility. Further work was also focused on investigating the eco/cytotoxicity of binary mixtures of contaminants by resorting to a suite of bioassays with a diversity of microorganisms, yeasts, cells and artificial membranes. This thesis serves to demonstrate that lipid vesicles are versatile tools for investigation of the effect of contaminants on lipid bilayers and offer a valuable in-vitro alternative to avoid experimentation with living beings or cell testing. The ease of synthesis and manipulation of liposomes also allows the automation of these assays via flow approaches, thus simplifying experimental work and give relevant insight into the field of exposomics, such as effect direct analysis (EDA) of bioavailable fractions in an untargeted fashion.

[cat] L’exposició a la creixent presencia de contaminants emergents en el medi ambient és de cada dia més preocupant. Aquests contaminants no només provoquen un greu impacte mediambiental a tots els nivells de la xarxa tròfica sinó que són el motiu, junt a altres paràmetres genètics i socioeconòmics, de la major part de les malalties cròniques. Per a l’avaluació del risc dels contaminats de preocupació emergent en la biota, en aquest treball, s’han utilitzat liposomes com a model de membrana. De fet, el paper dels lípids en la homeòstasi de la membrana guanya, cada cop, més rellevància a mesura que es coneix com la seva alteració pot provocar canvis en las propietats fisicoquímiques de la membrana afectant a distintes funcions cel•lulars. En aquesta tesi s’han estudiat els efectes causats, directe o indirectament, per distints contaminants emergents, presents en productes farmacèutics i de cura personal, en diverses propietats de la membrana ja sigui l’ordre i empaquetament dels fosfolípids, la seva fluïdesa o hidratació. Els efectes membranotròpics així com la seva ubicació més probable i la interacció dels contaminants amb els fosfolípids de membrana van ser estudiats en una aproximació holística per mitjà de tècniques experimentals i computacionals amb l’objectiu d’obtenir una visió global i evitar males interpretacions. La idea d’avaluar la interacció contaminant-liposoma ens va dur al disseny d’un mètode en flux completament automatitzat caracteritzat per l’adquisició en temps real de dades de fluorescència, el seu processat i avaluació, sense intervenció humana i amb una alta reproductibilitat. A més, per tal d’investigar la cito/ecotoxicitat d’una mescla binària de contaminants, a un capítol de la tesi es varen realitzat una sèrie de bioassajos fent ús de cèl•lules, llevats, bacteris i membranes artificials. Els liposomes han demostrat ser una ferramenta versàtil per a la investigació de l’efecte de contaminants sobre la bicapa lipídica i ofereixen una alternativa in-vitro per tal d’evitar l’experimentació amb éssers vius o proves cel•lulars. La facilitat de síntesi i manipulació d’aquestes vesícules lipídiques també permet l’automatització d’aquests assajos liposomals per mitjà de plantejaments fluídics, fet que simplifica el treball experimental i ofereix noves aplicacions en el camp de l’exposòmica, com per exemple, l’anàlisi de l’efecte directe de fraccions biodisponibles de forma no dirigida.

[spa] La exposición a la creciente presencia de contaminantes emergentes en el medioambiente es cada vez más preocupante. Estos contaminantes no solo causan un grave impacto medioambiental a todos los niveles de la cadena trófica, sino que son el motivo, junto a otros parámetros genéticos y socioeconómicos, de la mayoría de enfermedades crónicas. Para la evaluación del riesgo de los contaminantes de preocupación emergente sobre los organismos, en este trabajo, se ha recurrido a los liposomas, un modelo de membrana. De hecho, el papel de los lípidos en la homeostasis de la membrana va ganando relevancia a medida que se va conociendo como su alteración puede causar cambios en las propiedades físicoquímicas de la membrana, afectando a varias funciones celulares. En esta tesis se han estudiado los efectos que causan, directa o indirectamente, distintos contaminantes emergentes, presentes en productos farmacéuticos y de cuidado personal, en diversas propiedades de la membrana, como el orden y empaquetamiento de los fosfolípidos, su fluidez e hidratación. Se estudiaron los efectos membranotrópicos así como la ubicación más probable y la interacción de los contaminantes con los fosfolípidos de membrana mediante una aproximación holística a través de técnicas experimentales y computacionales con el fin obtener una visión global y evitar interpretaciones erróneas. La idea de evaluar la interacción contaminantes-liposoma nos llevó al diseño de un método en flujo completamente automatizado capaz de obtener datos de fluorescencia a tiempo real, su procesado y evaluación, sin intervención humana y con una elevada reproducibilidad. Además, con el fin de investigar la cito/ecotoxicidad de una mezcla binaria de contaminantes, otro capítulo de la tesis se destinó a la realización de una serie de bioensayos usando células, levaduras, bacterias y membranas artificiales. Los liposomas han demostrado ser una herramienta versátil para la investigación del efecto de contaminantes en bicapas lipídicas, y ofrecen una alternativa in-vitro para evitar la experimentación con seres vivos o pruebas celulares. La facilidad de síntesis y manipulación de estas vesículas lipídicas también permite la automatización de estos ensayos liposomales a través de enfoques fluídicos, lo que simplifica el trabajo experimental y ofrece aplicaciones nuevas en el campo de la exposómica, como el análisis de efecto directo de fracciones biodisponibles de manera no dirigida.