Estudi de l'expressió del gen PATJ en neutròfils en resposta a estímuls activadors

Abstract

[cat] L’ictus és una de les malalties amb major mortalitat i la causa principal de discapacitat en adults a Espanya. Recentment s’ha descobert que la variant rs76221407 del gen PATJ està associada a mal pronòstic funcional després d’un ictus isquèmic. PATJ és una proteïna implicada en la formació de les unions oclusives entre cèl·lules endotelials. Estudis preliminars del grup receptor han mostrat que PATJ s’infra-expressa en cèl·lules endotelials després d’un ictus isquèmic, afavorint així la seva transició a cèl·lules mesenquimals i facilitant l’angiogènesi. Per altra banda, els neutròfils són les úniques cèl·lules leucocitàries que expressen PATJ. Els neutròfils juguen un paper important en el dany isquèmic. Després de l'ictus, se produeix permeabilització de la barrera hematoencefàlic, i els neutròfils s'infiltren cap al parènquima cerebral migrant a la zona de penombra colindant a la lesió isquèmica en resposta a citocines quimiotàctiques. Allà alliberen més citocines, exacerbant així la resposta neuroinflamatòria. Actualment no sabem quin és el paper de PATJ en neutròfils. La hipòtesi d’aquest treball és que PATJ participa en processos de migració, adhesió i/o infiltració en neutròfils modulant l’expressió del receptor de citocines CXCR2. Per respondre a la hipòtesis en aquest estudi hem plantejat els següents objectius: 1. Generar un protocol d'aïllament i cultiu de neutròfils primaris. 2. Estudiar l'expressió de PATJ i del receptor CXCR2 en neutròfils en resposta a diferents estímuls quimiotàctics. En primer lloc, s’ha aconseguit establir un protocol d’aïllament de neutròfils a partir de mostres de sang i mantenir la seva supervivència en cultiu fins a 48 hores emprant els estímuls phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) i granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). En segon lloc, els estudis d’expressió mitjançant RT-PCR han demostrat que tant PATJ com CXCR2 es sobreexpressen en resposta a PMA i G-CSF. No obstant això, les limitacions del treball, destacant la poca quantitat d’ARN que es va poder extreure dels neutròfils, no permeten concloure si dita sobreexpressió ocorre a les primeres hores d’estimulació o si apareix més tard.

[eng] Stroke is the leading cause of disability worldwide. It has recently been discovered that the rs76221407 variant of the PATJ gene is associated with poor functional outcome after ischemic stroke. PATJ is a protein involved in the formation of tight junctions between endothelial cells. Preliminary data from the research group have shown on the one hand that PATJ is downregulated in endothelial cells after ischemic stroke, thereby promoting endothelial to mesenchymal transition and activation of angiogenesis. On the other hand, they have shown that neutrophils are the only leukocyte cells that express PATJ. Neutrophils play a critical role in ischemic damage. After ischemic stroke, there is a disruption of the blood-brain barrier and neutrophil infiltrate through the brain parenchyma towards the penumbra area in where they release more cytokines, thus exacerbating the neuroinflammatory response. The role of PATJ in neutrophils is currently unknown. The hypothesis of this work is that PATJ participates in migration, adhesion and/or infiltration processes in neutrophils by modulating the expression of the CXCR2 cytokine receptor. The study had two specific aims: SA-I, to generate a protocol for primary neutrophils isolation and culture. SA-II, to study PATJ and CXRX2 gene expression in neutrophils upon culture with different chemotactic stimuli. A viable protocol has optimized to isolate neutrophils from blood and maintaining their survival in culture for up to 48 hours using phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) as stimuli. RT-PCR expression studies have shown that both PATJ and CXCR2 overexpress in response to PMA and G-CSF. However, due to the low RNA amounts that could be extracted from neutrophils, we cannot clearly conclude whether the overexpression of PATJ and CXCR2 occurs in the early hours of stimulation or whether it appears later.