Estrategias de Klebsiella Pneumoniae para subvertir los sistemas defensivos del huésped

Abstract

[spa] Klebsiella pneumoniae (KP) es uno de los principales patógenos nosocomiales y un notable causante de infecciones adquiridas en la comunidad, hechos que suponen un importante problema de salud pública. Además, en los últimos años está aumentando constantemente el número de aislados de KP resistentes a antibióticos, lo cual agrava la problemática clínico-económica asociada a estas infecciones. Por eso, necesitamos desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra KP. Así, aparte de nuevos fármacos destinados a tener una actividad bacteriostática/bactericida directa, encontrar dianas para optimizar la respuesta inmune del huésped contra KP, es un campo de estudio que se debe expandir. Para ello es necesario conocer mejor el proceso de infección por KP y los factores de virulencia que usa la bacteria para llevarla a cabo. Del mismo modo, es importante conocer las vías de señalización que se activan en las células del huésped durante la infección, ya que la subversión de la inflamación y de la inmunidad innata son esenciales para la supervivencia de KP y la progresión de la infección. Ganar conocimiento acerca de estos procesos podría suponer una fuente de dianas terapéuticas eficaces para el desarrollo de fármacos contra KP. El calcio libre (Ca2+) y el AMP cíclico son dos importantes segundos mensajeros implicados en gran variedad de procesos celulares. En algunas infecciones bacterianas, la señalización dependiente de ellos está involucrada en la secreción de mediadores pro-inflamatorios. Otro importante facilitador de la inmunidad innata es la familia de los interferones, que una vez segregados al medio y detectados por las células, ponen en marcha rutas de señalización a la postre inflamatorias, importantes no solamente durante infecciones víricas sino también bacterianas. La relación de estos mensajeros y vías con el regulador transcripcional NF-κB, que en última instancia gobierna la expresión de genes pro-inflamatorios es muy estrecha y bien conocida. Sin embargo, estos campos no están apenas estudiados en relación al caso concreto de las infecciones por KP. En esta tesis se han estudiado en profundidad estas vías de señalización, en concreto en relación a la atenuación de la respuesta inflamatoria del huésped, activamente promovida por KP como una de sus principales estrategias para tener éxito en la infección. Nuestros resultados muestran que KP induce un aumento del Ca2+ intracelular libre procedente de su liberación del retículo endoplásmico (RE) en células pulmonares humanas. Esta señalización se lleva a cabo principalmente a través de la activación de TLR1/2, aunque también participa la activación de TLR4, y para ella son imprescindibles la presencia de Ca2+ extracelular, la viabilidad de KP y ciertos factores de virulencia, entre los que destaca especialmente la cápsula. La detección de KP por parte estos receptores parece causar la fosforilación de PLCγ, de la cual se deriva la consiguiente y mencionada liberación del Ca2+ desde el RE, que desemboca en el incremento del AMP cíclico. Este incremento conduciría a la presumible fosforilación del regulador CREB, que compite con NF-κB por la promoción de la expresión de los respectivos genes bajo su control, finalmente consiguiendo una atenuación de la respuesta inflamatoria. Por otro lado, nuestros resultados sugieren que KP inhibe activamente la fosforilación de STAT1, bloqueando así la señalización inflamatoria dependiente de IFNs (por una vía ajena a las proteínas SOCS1, SOCS3 y SHP2), para lo cual es esencial la viabilidad bacteriana. Los resultados presentados en esta tesis nos permiten proponer un novedoso modelo de atenuación inflamatoria promovida activamente por parte de KP, revelando nuevas estrategias que sigue esta especie para subvertir la respuesta inmune del hospedador, y que destacan por su complejidad al afectar a diferentes rutas de señalización (Ca2+, AMP cíclico e IFNs-dependientes).

[cat] Klebsiella penumoniae (KP) és un dels principals patògens nosocomials i un notable agent causant d’infeccions adquirides en la comunitat, fets que suposen un important problema de salut pública. A més, en els darrers anys està augmentant constantment el nombre d’aïllats de KP resistents als antibiòtics, cosa que agreuja la problemàtica clínica-econòmica associada a aquestes infeccions. Per això, necessitem desenvolupar noves estratègies terapèutiques contra KP. Així, apart de nous fàrmacs destinats a tenir una activitat bacteriostàtica/bactericida directa, trobar dianes per optimitzar la resposta immune de l’hoste contra KP, és un camp d’estudi que s’ha d’expandir. Per això és necessari conèixer millor el procés d’infecció per KP i els factors de virulència que usa la bactèria per dur-la a terme. Igualment, és important conèixer les vies de senyalització activades en les cèl·lules de l’hoste durant la infecció, ja que la subversió de la inflamació i de la immunitat innata són essencials per a la supervivència de KP i la progressió de la infecció. Guanyar coneixement sobre aquests processos suposaria una font de dianes terapèutiques eficaces per el desenvolupament de fàrmacs contra KP. El calci lliure (Ca2+) i l’AMP cíclic són dos importants segons missatgers implicats en gran varietat de processos cel·lulars. En algunes infeccions bacterianes, la senyalització dependent d’ells està involucrada en la secreció de mediadors proinflamatoris. Un altre facilitador de la immunitat innata és la família dels interferons, que una vegada secretats i detectats per les cèl·lules, posen en marxa rutes de senyalització al cap i a la fi inflamatòries, importants no només durant infeccions víriques sinó també bacterianes. La relació d’aquests missatgers i vies amb el regulador transcripcional NF-κB, que en darrera instància governa la expressió de gens pro-inflamatoris és molt estreta i ben coneguda. Malgrat això, aquests camps no estan quasi estudiats en relació al cas concret de les infeccions per KP. En aquesta tesi s’han estudiat en profunditat aquestes vies de senyalització, en concret en relació a la atenuació de la resposta inflamatòria de l’hoste, activament promoguda per KP com una de les seves principals estratègies per tenir èxit a la infecció. Els nostres resultats mostren que KP indueix un augment del Ca2+ intracel·lular lliure procedent de la seva alliberació del reticle endoplàsmic (RE) en cèl·lules pulmonars humanes. Aquesta senyalització es porta a terme principalment a través de la activació de TLR1/2, malgrat també hi participa la activació de TLR4, i per ella són imprescindibles la presencia de Ca2+ extracel·lular, la viabilitat de KP i certs factors de virulència, entre els que destaca especialment la càpsula. La detecció de KP per part d’aquests receptors sembla causar la fosforil·lació de PLCγ, de la qual es deriva la conseqüent i mencionada alliberació del Ca2+ des del RE, que desemboca en l’increment de l’AMP cíclic. Aquest increment conduiria a la presumible fosforil·lació del regulador CREB, que competeix amb NF-κB per la promoció de la expressió dels seus respectius gens baix el seu control, finalment aconseguint una atenuació de la resposta inflamatòria. Per altra banda, els nostres resultats suggereixen que KP inhibeix activament la fosforil·lació de STAT1, bloquejant així la senyalització inflamatòria depenent de IFNs (per una via aliena a les proteïnes SOCS1, SOCS3 i SHP2), per lo qual és essencial la viabilitat bacteriana. Els resultats presentats en aquesta tesi ens permeten proposar un nou model d’atenuació inflamatòria promoguda activament per part de KP, revelant noves estratègies que segueix aquesta espècie per subvertir la resposta immune de l’hoste, i que destaquen per la seva complexitat al afectar a diferents rutes de senyalització (Ca2+, AMP cíclic i IFNs-dependents).

[eng] Klebsiella pneumoniae (KP) is one of the main nosocomial opportunistic pathogens as well as a notable cause of community-acquired infections, facts that pose an important problem of public health. Additionally, during the last years, the number of antibiotic-resistant KP isolates is constantly increasing, facts that aggravate the clinical-economical implications associated with the infection by this species. It is obvious, therefore, that we need to develop new therapeutic strategies against KP. Thus, besides new drugs intended to have direct bacteriostatic/bactericidal activity, finding targets to improve the immune response of the host against KP, is a research field that needs to be expanded. Therefore, to deeply understand the KP infection process and the virulence factors used by KP, is urgently needed. Similarly, it is important to dissect the signaling pathways activated in the host cells during infection, since the subversion of the inflammation and the innate immunity are essential strategies used by KP for the progression of the infection. To acquire knowledge about these processes could be a decisive source of effective therapeutic targets for the future development of drugs against KP. The free calcium (Ca2+) and the cyclic AMP are two important second messengers involved in a wide variety of cellular processes. In some bacterial infections, several signaling pathways strongly depending on them ultimately promote the secretion of inflammatory mediators. Another important stimulator of the innate immunity is the interferon family, which once secreted to the medium and detected by the cells, start signaling pathways that ultimately are inflammatory, important not only during viral but also bacterial infections. The relation of these messengers and pathways with the NF-κB transcriptional regulator, which controls the expression of certain proinflammatory genes, is tight and well-known. However, these fields are poorly studied regarding the specific case of KP infections. In this thesis, we deeply studied these signaling pathways, specifically about the attenuation of the inflammatory response in the host, actively induced by KP as one of their main strategies to succeed. Our results show that KP induces an increase in intracellular free Ca2+ through its release from the endoplasmic reticulum (ER) in human lung cells. This signaling is carried out mainly through the activation of TLR1/2, although TLR4 also takes part in the process, , for which the presence of extracellular Ca2+, the KP viability, and some virulence factors (being the capsule probably the most important), are required. The detection of KP by these receptors seems to cause the phosphorylation of PLCγ , that triggers the Ca2+ release from the ER, which ultimately causes the increase of cyclic AMP. This increase would drive to the presumable phosphorylation of CREB, which competes with NF-κB for the promotion of the expression of their respective controlled genes, causing a final mitigation of the inflammatory response. On the other hand, our results suggest that KP actively inhibits the phosphorylation of STAT1, therefore blocking the IFNs-dependent inflammatory signaling (through a pathway independent of the proteins SOCS1, SOCS3, and SHP2), process for which the bacterial viability is essential. The results presented in this thesis allow us to propose a new model of attenuation of the inflammatory response actively promoted by KP, revealing new strategies that this species follow to subvert the host immune response, and that stand out due to their complexity, since they affect different signaling pathways (Ca2+, cyclic AMP, and IFNs-dependent).