A new therapeutic target for the treatment of glioma and other types of cancer: design, research, and development of glucosylceramide synthase inhibitors

Abstract

[spa] El glioblastoma es uno de los tipos de cáncer cerebral más frecuentes, a pesar de ser considerada una enfermedad rara por su prevalencia de 3.1 casos por cada 100.000 habitantes. La supervivencia media tras diagnóstico es de sólo 14,6 meses con el tratamiento actual, que combina radioterapia y temozolomida. La necesidad de atravesar la barrera hematoencefálica y la alta resistencia a fármacos que presentan estos tumores refuerzan la necesidad de desarrollar nuevas terapias. La empresa que ha desarrollado este proyecto es pionera en la meliterapia (Terapia Lipídica de Membrana). Este enfoque busca regular diversas funciones celulares a través de modificar la composición, estructura y metabolismo lipídicos, que se han demostrado que están alterados en numerosas patologías. La diana en este proyecto ha sido la enzima glucosilceramida sintasa, codificada por el gen UGCG. Esta enzima del metabolismo esfingolipídico sintetiza glucosilceramida a partir de ceramida. Esta fue elegida al observar en una base de datos de pacientes de glioma que sus niveles de expresión en el tumor estaban muy relacionados con la supervivencia media: Los niveles altos de expresión reducían notablemente la supervivencia, mientras que aquellos pacientes con niveles bajos de expresión tenían mejor pronóstico y mayor esperanza de vida. En este proyecto se ha podido demostrar que la inhibición específica de la expresión de UGCG provocaba una clara disminución de la capacidad proliferativa de varias líneas celulares humanas de glioma. Este efecto antitumoral fue confirmado en modelos animales, donde se observó una notable disminución de la progresión tumoral únicamente debida a la reducción de la expresión de UGCG. A nivel molecular se encontró una reducción en los niveles de proteínas esenciales para la progresión del ciclo celular como Ciclina D3 y DHFR. Además, de forma consistente se encontró una reducción en los niveles y en la fosforilación de EGFR, un receptor clave implicado en proliferación y comúnmente mutado en glioma. Por último, células con la expresión de UGCG inhibida respondían peor a factores de crecimiento y mostraban niveles reducidos de p-s6RP y p-p38, proteínas efectoras de las vías de PI3K/Akt y MAPK. La inhibición de la actividad de la glucosilceramida sintasa, por inhibidores comerciales, también provocaba la muerte celular en líneas humanas de glioma, debido a una reducción en proteínas claves para la progresión del ciclo celular, inhibición de la vía de PI3K/Akt e inducción de autofagia. Para estudiar su unión a distintas moléculas, se elucidó por primera vez un modelo de la estructura tridimensional de la glucosilceramida sintasa mediante técnicas computacionales y se sugirió un posible sitio de unión que encajaba con la escasa bibliografía existente referente a características estructurales de esta enzima. En base a este modelo se diseñaron nuevas moléculas patentables que tuviesen afinidad por esta enzima. Aquellas moléculas más prometedoras, PE109-C5-2D y PE109-C11-2D, se sintetizaron y se estudiaron. A pesar de que estas moléculas no inhibieron la glucosilceramida sintasa, regularon por completo la composición lipídica de células de glioma, además presentaron una actividad antiproliferativa y mecanismos de acción muy prometedores. Estas moléculas han demostrado un potente efecto antitumoral en modelos celulares y animales, reduciendo la progresión tumoral sin aparentes efectos secundarios ni toxicidad en estos últimos. A nivel molecular, estos nuevos compuestos inhibieron marcadamente el ciclo celular y la vía de PI3K/Akt, para, finalmente, desencadenar autofagia como mecanismo de muerte inducido. Como resultado, en este proyecto se han obtenido dos nuevas moléculas con perfiles de eficacia y seguridad prometedores, cuyo desarrollo podría mejorar el tratamiento clínico y calidad y esperanza de vida de numerosos pacientes de glioblastoma y otros tipos de cáncer.

[cat] El glioblastoma és un dels tipus de càncer cerebral més freqüents, tot i ser considerada una malaltia rara per la seva prevalença de 3,1 casos per cada 100.000 habitants. La supervivència mitjana després diagnòstic és de només 14,6 mesos amb el tractament actual, que combina radioteràpia i temozolomida. La necessitat de travessar la barrera hematoencefàlica i l'alta resistència a fàrmacs que presenten aquests tumors reforcen la necessitat de desenvolupar noves teràpies. L'empresa que ha desenvolupat aquest projecte és pionera en la meliterapia (Teràpia Lipídica de membrana). Aquest enfocament cerca regular diverses funcions cel·lulars a través de modificar la composició, estructura i metabolisme lipídics, que han demostrat que estan alterats en nombroses patologies. La diana en aquest projecte ha estat l'enzim glucosilceramida sintasa, codificada pel gen UGCG. Aquest enzim de el metabolisme esfingolipídic sintetitza glucosilceramida a partir de ceramida. Aquesta va ser triada observant en una base de dades de pacients de glioma que els seus nivells d'expressió en el tumor estaven molt relacionats amb la supervivència mitjana: Els nivells alts d'expressió reduïen notablement la supervivència, mentre que aquells pacients amb nivells baixos d'expressió tenien millor pronòstic i major esperança de vida. En aquest projecte s'ha pogut demostrar que la inhibició específica de l'expressió de UGCG provocava una clara disminució de la capacitat proliferativa de diverses línies cel·lulars humanes de glioma. Aquest efecte antitumoral va ser confirmat en models animals, on es va observar una notable disminució de la progressió tumoral únicament deguda a la reducció de l'expressió de UGCG. A nivell molecular es va trobar una reducció en els nivells de proteïnes essencials per a la progressió del cicle cel·lular com Ciclina D3 i DHFR. A més, de forma consistent es va trobar una reducció en els nivells i en la fosforilació de EGFR, un receptor clau implicat en proliferació i comunament mutat en glioma. Finalment, cèl·lules amb l'expressió de UGCG inhibida responien pitjor a factors de creixement i mostraven nivells reduïts de p-s6RP i p-p38, proteïnes efectores de les vies de PI3K/Akt i MAPK. La inhibició de l'activitat de la glucosilceramida sintasa, per inhibidors comercials, també provocava la mort cel·lular en línies de glioma, a causa d'una reducció en proteïnes claus per al cicle cel·lular, inhibició de la via de PI3K/Akt i inducció d'autofàgia. Per estudiar la seva unió a diferents molècules, es va elucidar per primera vegada un model de l'estructura tridimensional de la glucosilceramida sintasa mitjançant tècniques computacionals i es va suggerir un possible lloc d'unió que encaixava amb l'escassa bibliografia existent referent a característiques estructurals d'aquest enzim. En base a aquest model es van dissenyar noves molècules patentables que tinguessin afinitat per aquest enzim. Les molècules més prometedores, PE109-C5-2D i PE109-C11-2D, es van sintetitzar i es van estudiar. Tot i que aquestes molècules no van inhibir la glucosilceramida sintasa, van regular per complet la composició lipídica de cèl·lules de glioma, a més van presentar una activitat antiproliferativa i mecanismes d'acció molt prometedors. Aquestes molècules han demostrat un potent efecte antitumoral en models cel·lulars i animals, reduint la progressió tumoral sense aparents efectes secundaris ni toxicitat en aquests últims. A nivell molecular, aquests nous compostos van inhibir marcadament el cicle cel·lular i la via de PI3K/Akt, per, finalment, desencadenar autofàgia com a mecanisme de mort induït. Com a resultat, en aquest projecte s'han obtingut dues noves molècules amb perfils d'eficàcia i seguretat prometedors, el desenvolupament d'aquestes podria millorar el tractament clínic i qualitat i esperança de vida de nombrosos pacients de glioblastoma i altres tipus de càncer.

[eng] Glioblastoma is one of the most frequent types of brain cancer, despite being considered a rare disease due to its prevalence of 3.1 cases per 100.000 people. Median survival after diagnosis is only 14.6 months with current treatment, which combines radiation therapy and temozolomide. The need to cross the blood-brain barrier and the high resistance to treatment that these tumors present reinforce the need to develop new therapies. The company that has developed this project is a pioneer in melitherapy (Membrane-Lipid Therapy). This approach seeks to regulate various cellular functions by modifying lipid composition, structure, and metabolism, which have been shown to be altered in numerous pathologies. The target in this project has been the enzyme glucosylceramide synthase, encoded by the UGCG gene. This enzyme of the sphingolipid metabolism synthesizes glucosylceramide from ceramide. UGCG was chosen when observing in a database of glioma patients that its expression levels in the tumor were closely related to median survival: High expression levels markedly reduced survival, while those patients with low expression levels had better prognosis and longer life expectancy. In this project it was possible to demonstrate that the specific inhibition of UGCG expression caused a clear decrease in the proliferative capacity of several human glioma cell lines. This antitumor effect was confirmed in animal models, where a notable decrease in tumor progression was observed solely due to the reduction of UGCG expression. At molecular level, a reduction was found in the levels of essential proteins for cell cycle progression such as Cyclin D3 and DHFR. Furthermore, a reduction in the levels and phosphorylation of EGFR, a key receptor involved in proliferation and commonly mutated in glioma, was consistently found. Finally, cells with UGCG expression inhibited responded worse to growth factors and showed reduced levels of p-s6RP and p-p38, effector proteins of the PI3K/Akt and MAPK pathways. Inhibition of glucosylceramide synthase activity by commercial inhibitors also caused cell death in human glioma cell lines, due to a reduction in key proteins for cell cycle progression, inhibition of the PI3K/Akt pathway and induction of autophagy. In order to study its binding to different molecules, a three-dimensional model of glucosylceramide synthase structure was built for the first time using computational techniques and a possible binding site was suggested that fit with the limited existing literature regarding structural characteristics of this enzyme. Based on this model, new patentable molecules were designed that had an affinity for this enzyme. Those most promising molecules, PE109-C5-2D and PE109-C11-2D, were synthesized and studied. Even though these molecules did not inhibit glucosylceramide synthase, they completely regulated the lipid composition of glioma cells, and also showed very promising antiproliferative activity and mechanism of action. These molecules have demonstrated a potent antitumor effect in cell and animal models, reducing tumor progression without apparent side effects or toxicity in the latter. At molecular level, these new compounds markedly inhibited the cell cycle and the PI3K/Akt pathway, triggering autophagy as an induced death mechanism. As a result, in this project two new molecules with promising efficacy and safety profiles have been obtained, whose development could improve the clinical treatment and quality of life of numerous patients with glioblastoma and other types of cancer