Novel treatment strategies for chronic respiratory infections based on the analysis of antimicrobial resistance dynamics in Pseudomonas aeruginosa biofilms

Abstract

[eng] Pseudomonas aeruginosa is the major cause of chronic respiratory infections (CRI) and the main driver of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF) patients. The establishment of P. aeruginosa CRI requires a complex adaptive process that includes the selection of an important number of mutations required for long-term persistence and the transition from the planktonic to biofilm mode of growth, a hallmark of chronic infections. The complex spatial structure of the biofilm and the antibiotic selective pressure lead to evolve of heterogeneous communities conformed by different subpopulations that coexist and interact establishing diverse social behaviors. Moreover, the prolonged antibiotic treatments required in CRI unavoidably entail an increase of resistance. Traditional therapeutic strategies to control P. aeruginosa infection in CF patients based on the use of a single nebulized antibiotic seem to be ineffective over time. First, this work determined whether antibiotic resistant mutants display selfish or altruistic behaviors in mixed P. aeruginosa biofilms exposed to antibiotics. ECFP-tagged strain PAO1 and its EYFP-tagged derivatives hyperproducing the β-lactamase AmpC or the efflux pump MexAB-OprM were used to develop single or mixed biofilms. Mature biofilms were challenged with different concentrations of β-lactams to monitor biofilm structural dynamics, using confocal laser scanning microscopy (CLSM), and population dynamics, through enumeration of viable cells. While exposure of single wild-type PAO1 biofilms to β-lactams lead to a major reduction in bacterial load, it had little effect on biofilms formed by the resistant mutants. However, the most revelling finding was that bacterial load of wild-type PAO1 was significantly increased when growing in mixed biofilms compared to single biofilms. In agreement with CFU enumeration data, CLSM images revealed the amplification of the resistant mutants and their protection of susceptible populations. These findings show that mutants expressing diverse resistance mechanisms, including β-lactamases, but also, as evidenced for the first time, efflux pumps, protect the whole biofilm community, preserving susceptible populations from the effect of antibiotics. Finally, this work also evaluated the therapeutic efficacy and dynamics of antibiotic resistance in P. aeruginosa biofilms under sequential therapy with inhaled aztreonam (ATM) and tobramycin (TOB). Biofilms of laboratory and clinical strains were developed using the flow cell system. Mature biofilms were challenged with different concentrations of ATM and TOB and their alternations at different time point. The number of viable cells and resistant mutants were determined, and biofilm structural dynamics were monitored by CLSM. TOB monotherapy produced an intense decrease of CFUs that was not always correlated with a reduction of biomass and/or bactericidal effect on biofilms, particularly for the CF strains. ATM monotherapy bactericidal effect was lower, but effects on biofilm biomass and/or structure, including intense filamentation, were documented. The alternation of TOB and ATM led to an enhancement of the antibiofilm activity against laboratory and CF strains compared to individual regimens, potentiating the bactericidal effect and/or the reduction of biomass. These results support the clinical evaluation of sequential regimens with inhaled antibiotics in CF, as opposed to current maintenance treatments with just one antibiotic in monotherapy. On the whole, this work provides new insights into the complexity of resistance development in biofilms, highlighting the significance of resistant mutants within heterogenous populations, and also represent a step forward for the development of new strategies for combating P. aeruginosa CRI.

[spa] Pseudomonas aeruginosa es la principal causa de infecciones respiratorias crónicas (IRC) y el principal responsable de la elevada morbilidad y mortalidad de los pacientes con fibrosis quística (FQ). La instauración de la IRC requiere un complejo proceso adaptativo que incluye la selección de un número importante de mutaciones, necesarias para la persistencia a largo plazo y conlleva la transición desde el modo de crecimiento planctónico al de biopelícula, un sello distintivo de las infecciones crónicas. La compleja estructura espacial de las biopelículas junto con la presión selectiva de antibióticos, da lugar a la evolución de comunidades heterogéneas conformadas por diferentes subpoblaciones que coexisten e interactúan estableciendo diversos comportamientos sociales. Además, lo prolongados tratamientos antibióticos empleados en la IRC conllevan, inevitablemente, un aumento de la resistencia. Las estrategias terapéuticas tradicionales para controlar la infección por P. aeruginosa en pacientes con FQ están basadas en el uso de un único antibiótico nebulizado y parecen ser ineficaces con el paso del tiempo. En primer lugar, este trabajo determinó si los mutantes resistentes de P. aeruginosa mostraban comportamientos egoístas o altruistas al ser estudiado en biopelículas mixtas durante el tratamiento antibióticos. Se emplearon para el estudio de biopelículas simples o mixtas la cepa PAO1 marcada con ECFP y derivados marcados con EYFP que hiperproducían la β-lactamasa AmpC o la bomba de expulsión MexAB-OprM. Las biopelículas maduras fueron expuestas a diferentes concentraciones de β-lactámicos para monitorear la dinámica estructural, utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM) y la dinámica de poblacional, a través del recuento de células viables. Si bien el tratamiento con β-lactámicos de biopelículas formadas por PAO1 condujo a una reducción importante de la carga bacteriana, tuvo poco efecto sobre las biopelículas formadas por los mutantes resistentes. Sin embargo, el hallazgo más revelador fue que la carga bacteriana de PAO1 aumentó significativamente cuando se crecía en biopelículas mixtas en comparación con las biopelículas individuales. De acuerdo con los recuentos de células viables, las imágenes CLSM mostraron la amplificación de los mutantes resistentes y la protección sobre las poblaciones sensibles. Estos hallazgos demuestran por primera vez que los mutantes que expresan diversos mecanismos de resistencia, tanto hiperproducción de β-lactamasa como hiperexpresión de bombas de flujo, protegen a toda la comunidad, preservando a las poblaciones susceptibles del efecto de los antibióticos. Por último, este trabajo también evaluó la eficacia terapéutica y la dinámica de la resistencia a los antibióticos en biopelículas expuestas a tratamiento secuencial con aztreonam (ATM) y tobramicina (TOB) simulando la terapia inhalada. Para su estudio se desarrollaron biopelículas de cepas clínicas y de laboratorio utilizando el sistema de celda de flujo. Las biopelículas maduras fueron tratadas con diferentes concentraciones de ATM y TOB y sus alternancias a diferentes tiempos. Se determinó tanto el número de células viables como de mutantes resistentes y se controló la dinámica estructural de las biopelículas mediante CLSM. La monoterapia con TOB produjo una intensa disminución de las células viables, que no siempre se correlacionó con una reducción de la biomasa y/o el efecto bactericida sobre las biopelículas, particularmente para las cepas de FQ. El efecto bactericida de la monoterapia con ATM fue menor, pero tuvo efecto sobre la biomasa y/o la estructura de las biopelículas, incluyendo un inteso efecto de filamentación. La alternancia de TOB y ATM supuso una mejora de la actividad antibiopelícula tanto frente a las cepas clínicas como de laboratorio, en comparación con los regímenes individuales, potenciando el efecto bactericida y/o la reducción de la biomasa. Estos resultados apoyan la evaluación clínica de regímenes secuenciales con antibióticos inhalados en la FQ, a diferencia de los tratamientos de mantenimiento actuales que emplean un solo antibiótico en monoterapia. En general, este trabajo proporciona nuevos conocimientos sobre la complejidad del desarrollo de resistencia en las biopelículas, destacando la importancia de los mutantes resistentes dentro de las poblaciones heterogéneas, y también representa un paso adelante para el desarrollo de nuevas estrategias que puedan combatir la IRC por P. aeruginosa.

[cat] Pseudomonas aeruginosa és la principal causa d`infeccions respiratòries (IRC) i el principal responsable de l´elevada morbiditat i mortalitat dels pacients amb fibrosi quística (FQ). La instauració de la IRC requereix un complex procés adaptatiu que inclou la selecció d´un número important de mutacions, necessàries per la persistència a llarg termini i comporta la transició des de el mode de creixement planctònic al de biopel·lícula, un segell distintiu de les infeccions cròniques. La complexa estructura espacial de les biopel·lícules junt amb la pressió selectiva d´antibiòtics donen lloc a l´evolució de comunitats heterogènies conformades per diferents subpoblacions que coexisteixen e interactuen establint diversos comportament socials. A més, els perllongats tractaments antibiòtics empleats en la IRC comporten, inevitablement, un augment de la resistència. Les estratègies terapèutiques tradicionals per controlar la infecció per P. aeruginosa amb pacients amb FQ estan basades en l´ús d´un únic antibiòtic nebulitzat i semblen ser eficaços amb el pas del temps. En primer lloc, aquest treball va determinar si els mutants resistents de P. aeruginosa mostraven comportaments egoistes o altruistes en ser estudiats amb biopel·lícules mixtes durant el tractament antibiòtic. Es van utilitzar per l´estudi de biopel·lícules simples o mixtes la soca PAO1 marcada amb ECFP i derivats marcats amb EYFP que híper produïen b-lactamasa AmpC o la bomba d´expulsió MexAB-OprM. Les biopel·lícules madures van ser exposades a diferents concentracions de b-lactàmics per monitoritzar la dinàmica estructural, utilitzant microscopía làser confocal (CLSM) i la dinàmica poblacional, a través del recompte de cèl·lules viables. Si bé el tractament amb b-lactàmics de biopel·lícules formades amb PAO1 condueix a una reducció important de la càrrega bacteriana, va tenir poc efecte sobre les biopel·lícules formades per els mutants resistents. No obstant, el descobriment més revelador , va ser que la càrrega bacteriana de PAO1 va augmentar significativament quan creixia amb biopel·lícules mixtes, amb comparació amb biopel·lícules individuals. D´acord amb els recomptes de cèl·lules viables , les imatges CLSM van mostrar l´amplificació dels mutants resistents i la protecció sobre les poblacions susceptibles. Aquets descobriments demostren per primera vegada que els mutants que expressen diversos mecanismes de resistència, tant de híper producció de b-lactamases com híper expressió de bombes de flux, protegeixen a tota la comunitat, preservant a les poblacions susceptibles de l´efecte dels antibiòtics. Per últim, aquest treball també va avaluar l’eficàcia terapèutica i la dinàmica de la resistència els antibiòtics amb biopel·lícules exposades a tractament seqüencial amb aztreonam (ATM) i tobramicina (TOB) simulant la teràpia inhalada. Per el seu estudi es van desenvolupar biopel·licules de soques clínics i de laboratori utilitzant el sistema del cel·la de flux. Les biopel·lícules madures van ser tractades amb diferents concentracions de ATM i TOB i les seves alternances a diferents temps. Es va determinar tant el número de cèl·lules viables com de mutants resistents i es va controlar la dinàmica estructural de les biopel·lícules mitjançant CLSM. La monoteràpia amb TOB va produir una intensa disminució de les cèl·lules viables, que no sempre es va correlacionar amb una reducció de la biomassa i/o l’efecte bactericida sobre les biopel·lícules, particularment per les soques de FQ. L’efecte bactericida de la monoteràpia amb ATM va ser menor, però va tenir efecte sobre la biomassa i/o l’estructura de les biopel·lícules, afegint un intens efecte de filamentació. L’alternança de TOB i ATM va suposar una millora de l’activitat antibiopel·lícula tant davant les soques clínics com del laboratori, amb comparació amb el règims individuals, potenciant l’efecte bactericida i/o la reducció de la biomassa. Aquests resultats secunden l’avaluació clínica de règims seqüencials amb antibiòtics inhalats en la FQ, a diferencia dels tractaments de manteniment actuals que utilitzen un sol antibiòtic en monoteràpia. En general aquest treball proporciona nous coneixements sobre la complexitat del desenvolupament de resistència en les biopel·lícules, destacant la importància dels mutants resistents dins de les poblacions heterogènies, i també representen un pas endavant per el desenvolupament de noves estratègies que puguin combatre la IRC per P.aeruginosa.