Análisis de la actividad antimicrobiana de proteínas bacterianas purificadas con capacidad natural de degradar el peptidoglicano

Abstract

[spa] A consecuencia del incremento global de la resistencia antibiótica, se da una disminución progresiva de la efectividad de los tratamientos clásicos, dando pie a la necesidad de hallar terapias alternativas. Una estrategia muy poco explorada podría ser explotar algunos enzimas bacterianos con actividad lítica sobre el peptidoglicano (PGN) como aliados antimicrobianos. Por ejemplo, en Pseudomonas aeruginosa se han descrito los enzimas Tse1 y AmpDh3, ligados al sistema de secreción tipo VI, que los inyecta en células competidoras para degradar su PGN, causando su lisis. Además, ciertos estudios han propuesto la existencia de una actividad residual lítica del PGN propio por parte de las β–lactamasas AmpC y OXA-539, como causas de la disminución de la virulencia en la propia bacteria productora. Estos antecedentes sugieren un potencial PGN-lítico aprovechable en los mencionados 4 enzimas, de forma que el objetivo de este trabajo fue averiguar experimentalmente esta posibilidad sobre sustratos purificados en ensayos in vitro, así como su aplicabilidad para ser usados como agentes bacteriostáticos/bactericidas sobre patógenos relevantes (P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae). Los resultados obtenidos sugirieron la capacidad de AmpC, Tse1 y AmpDh3 para degradar in vitro tanto el PGN de Gram-positivos como –negativos (con mayor eficacia sobre este último), así como una importante actividad de las 4 proteínas, al combinarlas con un permeabilizante (concentraciones bacteriostáticas/bactericidas generalmente por debajo de 0,2 µM), sobre K. pneumoniae. Estos resultados constituyen una prueba de concepto demostrando que ciertas proteínas PGN-líticas de origen bacteriano pueden tener utilidad desde el punto de vista terapéutico, aunque futuros trabajos con otras especies y un mayor número de cepas son necesarios para confirmarlo.

[cat] Com a conseqüència de l’increment global a la resistència antibiòtica, es duu a terme una disminució progressiva de l’efectivitat dels tractaments clàssics, donant peu a la necessitat de trobar teràpies alternatives. Una estratègia molt poc explorada podria ser l’explotació d’alguns enzims bacterians amb activitat lítica sobre el peptidoglicà (PGN) com aliats antimicrobians. Per exemple, a Pseudomonas aeruginosa s’han descrit els enzims Tse1 y AmpDh3, lligats al sistema de secreció de tipus VI, qui s’encarrega d’injectar-los a les cèl·lules competidores per tal de degradar el seu PGN, donant lloc a la seva lisi. A més, certs estudis han proposat l’existència d’una activitat residual lítica del PGN propi per part de les β–lactamases AmpC i OXA-539, com causes de la disminució de la virulència a pròpia bactèria productora. Aquests antecedents suggereixen un potencial PGN-lític aprofitable en els 4 enzims mencionats, de tal forma que l’objectiu d’aquest treball fou esbrinar experimentalment aquesta possibilitat sobre substrats purificats a assatjos in vitro, així com la seva. Aplicabilitat per a ser emprats com agents bacteriostàtics/bactericides sobre patògens rellevants(P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae). Els resultats obtinguts suggeriren la capacitat de AmpC, Tse1 y AmpDh3 per degradar in vitro tant PGN Gram-positiu com Gram-negatiu (amb major eficàcia d’aquest darrer), així com una important activitat de les 4 proteïnes, al combinar-se amb un permeabilitzant. (concentracions bacteriostàtiquesbactericides generalment per davall de 0,2 µM), sobre K. pneumoniae. Aquests resultats constitueixen una prova concepte demostrant que certes proteïnes PGN-lítiques d’origen bacterià poden tenir utilitat des de el punt de vista terapèutic, tot i que futurs treballs amb altres espècies i un major nombre de soques son necessàries per a confirmar-lo.

[eng] Because of the global growth of antibiotic resistance, the classic treatments have shown a decrease on their effectiveness, giving rise to the need to find alternative therapies.A very little explored strategy could be to exploit some bacterial enzymes with lytic activity on peptidoglycan (PGN) as antimicrobial allies. For example, the enzymes Tse1 and AmpDh3 have been described in Pseudomonas aeruginosa, these are linked to the type VI secretion system, which injects them into competing cells to erode their PGN, causing their lysis. In addition, certain studies have proposed the existence of a residual lytic activity of the PGN itself by the β-lactamases AmpC and OXA-539, as causes of the decrease in virulence in the producing bacterium itself. These antecedents suggest a usable PGN-lytic potential in the 4 enzymes, so the objective of this work was to experimentally investigate this possibility on purified substrates in in vitro assays, as well as their applicability to be used as bacteriostatic/bactericidal agents on other relevant pathogens (P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae). The results obtained suggest the ability of AmpC, Tse1 and AmpDh3 to degrade both Gram-positive and Gram-negative PGN in vitro assays (with the highest efficiency on the last one), as well as an important activity of the 4 proteins, when combined with a permeability agent (bacteriostatic-bactericidal concentrations generally below 0.2 µM), on K. pneumoniae. These results constitute a proof concept demonstrating that certain PGN-lytic proteins of bacterial origin may have utility from a therapeutic point of view, and future studies made with other species and a better name of bacterial strains will be need it to confirm it.