Micro-immunotherapy as a therapeutic approach for periodontitis and osteoporosis: biocompatibility and preclinical efficacy evaluation

Abstract

[eng] Periodontitis and osteoporosis are chronic diseases with shared risk factors, both characterized by inflammation and bone resorption, presenting significant public health challenges. The pathogenesis of periodontitis involves a complex interplay of microbial dysbiosis and host immune responses, resulting in the destruction of periodontal tissues and alveolar bone loss. Osteoporosis, on the other hand, is a skeletal disorder defined by a reduction in bone mass and density due to disruptions in the bone remodelling process, leading to an increased risk of fractures, particularly in postmenopausal women. Current treatments for these diseases, although effective, often present side effects and limited long-term efficacy. In response, this thesis explores the potential of low-dose (LD) and ultra-low-dose (ULD) micro-immunotherapy (MI) treatments to overcome these limitations and provide new therapeutic approaches for managing both diseases. This thesis explores the biocompatibility and efficacy of different active ingredients either alone or in combination in the form of MI medicines (MIM), specifically LD bone morphogenetic proteins (BMP2 and BMP4), ULD RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), and a sequential MIM treatment (MIM-seq), in in vitro and in vivo preclinical models.

First studies explore the biocompatibility and efficacy of LD BMP4 and LD BMP2 on human gingival fibroblasts (hGF) and a 3D gingival tissue equivalent (GTE) under inflammatory conditions. These studies aim to evaluate cytotoxicity, inflammation markers, and tissue regeneration capabilities, with a focus on collagen metabolism. The results showed that LD BMP4 exhibited promising anti-inflammatory properties and enhanced collagen metabolism with a higher extent that LD BMP2 on hGF, and improved viability of 3D GTE under inflammatory conditions, making it a viable candidate for further testing. Subsequently, MIM-seq treatment also presented good biocompatibility, anti-inflammatory effects and restoration of collagen content in hGF under inflammatory conditions. In the 3D GTE model, MIM-seq treatment promoted higher collagen content, although the anti-inflammatory effect could not be confirmed. In a second in vitro study, osteoblast or adipogenic fate differentiation of human bone barrow mesenchymal stem cells (hBM-MSC) did not reveal conclusive effects for LD BMP4 and ULD RANTES MIM treatments, with variability in donor responses, although presented high biocompatibility.

Due to the positive results on in vitro studies, and to further validate the potential therapeutic efficacy of MIM tested, two different in vivo models were performed in this thesis. First, LD BMP4 and ULD RANTES treatments were applied in a rat model of periodontitis, involving ligature placement and lipopolysaccharide (LPS) injections around the first maxillary molars, effectively simulating gingival recession, alveolar bone loss, and inflammation, as observed in periodontitis. The study conducted analyses of key inflammatory and collagen mediators, composition of the oral microbiota in gingival crevicular fluid (GCF), and cone beam computed tomography (CBCT) to measure alveolar bone loss. The results showed that MIM treatments could not significantly reduce inflammation, collagen degradation, or alveolar bone loss. However, this study highlighted the potential of ULD RANTES to modulate oral microbiota, indicating a possible positive impact by promoting a healthier bacterial profile.

Finally, the potential of MIM-seq was investigated in an ovariectomized (OVX) rat model of postmenopausal osteoporosis. The MIM-seq treatment was evaluated in two conditions: as a preventive treatment for early-stage osteoporosis immediately following OVX, and as a therapeutic intervention for established osteoporosis, administered two months after OVX. The study assessed body composition, plasma biochemical markers of bone turnover, and bone quality through mechanical testing and micro-computed tomography (micro-CT) of trabecular bone. The results demonstrated that MIM-seq treatment tested improved the maximum load value of the fourth vertebral body and reduced the bone resorption marker CTX-I and upregulated the OPG/RANKL ratio in the early-stage osteoporosis model. However, in the established osteoporosis model, while the treatment significantly reduced the biomarker CTX-I, no significant improvement in bone quality was observed.

In conclusion, while MIM tested demonstrated significant biocompatibility, some anti-inflammatory and enhancing collagen metabolism effects in vitro, its efficacy in vivo requires further research. All in all, the results derived from this thesis explored for the first time the biocompatibility and preclinical efficacy of these MIM in the context of periodontitis and osteoporosis, offering insights into future MI therapeutic strategies.

[cat] La periodontitis i l'osteoporosi són malalties cròniques amb factors de risc compartits, totes dues caracteritzades per la inflamació i la resorció òssia, que plantegen importants reptes per a la salut pública. La patogènesi de la periodontitis implica una complexa interacció entre la disbiosis microbiana i les respostes immunitàries de l'hoste, la qual cosa provoca la destrucció dels teixits periodontals i la pèrdua d'os alveolar. L'osteoporosi, per altra banda, és un trastorn esquelètic definit per una reducció de la massa i la densitat òssia deguda a alteracions en el procés de remodelació, la qual cosa comporta un major risc de fractures, sobretot en dones post menopàusiques. Els tractaments actuals per a aquestes malalties, encara que eficaces, solen presentar efectes secundaris i una eficàcia limitada a llarg termini. En resposta, aquesta tesi explora el potencial dels tractaments de microimmunoteràpia (MI) de dosi baixa (LD) i i dosi ultra-baixa (ULD) per a superar aquestes limitacions i proporcionar nous enfocaments terapèutics per al tractament de totes dues malalties. En aquesta tesi s'explora la biocompatibilitat i l'eficàcia de diferents ingredients actius, sols o combinats, en forma de medicaments de MIM, concretament les proteïnes morfogenètiques òssies (BMP2 i BMP4) en LD, RANTES (Regulated upon Activation Normal T-cell Expressed and Secreted) en ULD, i un tractament seqüencial de MIM específic (MIM-seq), en models preclínics in vitro i in vivo.

Els primers estudis exploren la biocompatibilitat i eficàcia de LD BMP4 i LD BMP2, en fibroblasts gingivals humans (hGF) i un equivalent de teixit gingival 3D (GTE) en condicions inflamatòries. Aquests estudis tenen l’objectiu d’avaluar la citotoxicitat, els marcadors d'inflamació i les capacitats de regeneració tissular, amb especial atenció al metabolisme del col·lagen. Els resultats van mostrar que el tractament LD BMP4 presentava propietats antiinflamatòries prometedores i millorava el metabolisme del col·lagen amb una extensió major que LD BMP2 en hGF, i a la vegada millorava la viabilitat del teixit 3D en condicions inflamatòries, la qual cosa convertia a LD BMP4 en un candidat viable per a futurs estudis. Posteriorment, el tractament MIM-seq també va presentar una bona biocompatibilitat, efectes antiinflamatoris i restauració del contingut de col·lagen en el hGF en condicions inflamatòries. En el model gingival 3D, el tractament MIM-seq va promoure un major contingut de col·lagen, encara que no es va poder confirmar l'efecte antiinflamatori. Per l’altra banda, l'estudi in vitro de la diferenciació osteoblàstica o adipogènica de cèl·lules mare mesenquimals de medul·la òssia humana (hBM-MSC) no va revelar efectes conclusius per als tractaments LD BMP4 i ULD RANTES, amb variabilitat en les respostes dels donants, encara que va presentar una elevada biocompatibilitat.

Donat els resultats positius dels estudis in vitro, i per a validar amb més profunditat la possible eficàcia terapèutica dels MIM analitzats, en aquesta tesi es van utilitzar dos models in vivo diferents. En primer lloc, es van aplicar tractaments amb LD BMP4 i ULD RANTES en un model de periodontitis en rates, basat en la col·locació de lligadures i injeccions de lipopolisacàrid (LPS) als primers molars maxil·lars, simulant de manera efectiva la recessió gingival, la pèrdua d'os alveolar i la inflamació, tal com s'observa en la periodontitis. En aquest estudi es van analitzar els principals mediadors inflamatoris i del col·lagen, la composició de la microbiota oral en el líquid crevicular gingival (GCF) i la tomografia computada de feix cònic (CBCT) per a mesurar la pèrdua òssia alveolar. Els resultats van mostrar que els tractaments amb MIM no podien reduir significativament la inflamació, la degradació del col·lagen ni la pèrdua òssia alveolar. No obstant això, aquest estudi va posar de manifest el potencial del ULD RANTES per a modular la microbiota oral, la qual cosa indica un possible impacte positiu en promoure un perfil bacterià més saludable.

Finalment, es va investigar el potencial de MIM-seq en un model de rata ovariectomitzada (OVX) d'osteoporosi post menopàusica. El tractament MIM-seq es va avaluar en dues condicions: com a tractament preventiu per a l'osteoporosi en fase inicial immediatament després de la OVX, i com a intervenció terapèutica per a l'osteoporosi establerta, administrada dos mesos després de la OVX. L'estudi va avaluar la composició corporal, els marcadors bioquímics plasmàtics del recanvi ossi i la qualitat de l'os mitjançant proves mecàniques i micro-tomografia computada (micro-CT) de l'os trabecular. Els resultats van demostrar que el tractament amb MIM-seq va millorar la resistència òssia i va reduir els marcadors de resorció òssia en el model d'osteoporosi en fase inicial. No obstant això, en el model d'osteoporosi establerta, encara que el tractament va reduir significativament el biomarcador CTX-I, no es va observar cap millora significativa en la qualitat de l'os.

En conclusió, encara que els MIM analitzats van demostrar in vitro una bona biocompatibilitat i alguns efectes antiinflamatoris i potenciadors del metabolisme del col·lagen, la seva eficàcia in vivo requereix més recerca. En conjunt, els resultats derivats d'aquesta tesi han explorat per primera vegada la biocompatibilitat i l'eficàcia pre-clínica d’aquests MIM en el context de la periodontitis i l'osteoporosi, oferint noves perspectives per a futures estratègies terapèutiques.

[spa] La periodontitis y la osteoporosis son enfermedades crónicas con factores de riesgo compartidos, ambas caracterizadas por la inflamación y la resorción ósea, que plantean importantes retos para la salud pública. La patogénesis de la periodontitis implica una compleja interacción entre la disbiosis microbiana y las respuestas inmunitarias del huésped, lo que provoca la destrucción de los tejidos periodontales y la pérdida de hueso alveolar. La osteoporosis, por otra parte, es un trastorno esquelético definido por una reducción de la masa y la densidad ósea debida a alteraciones en el proceso de remodelación, lo que conlleva un mayor riesgo de fracturas, sobre todo en mujeres posmenopáusicas. Los tratamientos actuales para estas enfermedades, aunque eficaces, suelen presentar efectos secundarios y una eficacia limitada a largo plazo. En respuesta, esta tesis explora el potencial de los tratamientos de microinmunoterapia (MI) de dosis baja (LD) y dosis ultra-baja (ULD) para superar estas limitaciones y proporcionar nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de ambas enfermedades. En esta tesis se explora la biocompatibilidad y la eficacia de diferentes ingredientes activos, solos o combinados, en forma de medicamentos de MI (MIM), concretamente las proteínas morfogenéticas óseas (BMP2 y BMP4) en LD, RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted) en ULD, y un tratamiento secuencial de MIM específico (MIM-seq), en modelos preclínicos in vitro e in vivo.

Los primeros estudios exploran la biocompatibilidad y eficacia de LD BMP4 y LD BMP2, en fibroblastos gingivales humanos (hGF) y un equivalente de tejido gingival 3D (GTE) en condiciones inflamatorias. Estos estudios tienen el objetivo de evaluar la citotoxicidad, los marcadores de inflamación y las capacidades de regeneración tisular, con especial atención al metabolismo del colágeno. Los resultados mostraron que el tratamiento LD BMP4 presentaba propiedades antiinflamatorias prometedoras y mejoraba el metabolismo del colágeno con una extensión mayor que LD BMP2 en hGF, y a su vez mejoraba la viabilidad del tejido 3D en condiciones inflamatorias, lo que convertía a LD BMP4 en un candidato viable para futuros estudios. Posteriormente, el tratamiento MIM-seq también presentó una buena biocompatibilidad, efectos antiinflamatorios y restauración del contenido de colágeno en el hGF en condiciones inflamatorias. En el modelo gingival 3D, el tratamiento MIM-seq promovió un mayor contenido de colágeno, aunque no se pudo confirmar el efecto antiinflamatorio. En segundo lugar, el estudio in vitro de la diferenciación osteoblástica o adipogénica de células madre mesenquimales de médula ósea humana (hBM-MSC) no reveló efectos concluyentes para los tratamientos LD BMP4 y ULD RANTES, con variabilidad en las respuestas de los donantes, aunque presentaron una elevada biocompatibilidad.

Debido a los resultados positivos de los estudios in vitro, y para validar aún más la posible eficacia terapéutica de los MIM analizados, en esta tesis se utilizaron dos modelos in vivo diferentes. En primer lugar, se aplicaron tratamientos con LD BMP4 y ULD RANTES en un modelo de periodontitis en ratas, basado en la colocación de ligaduras e inyecciones de lipopolisacárido (LPS) alrededor de los primeros molares maxilares, simulando de forma efectiva la recesión gingival, la pérdida de hueso alveolar y la inflamación, tal y como se observa en la periodontitis. En este estudio se analizaron los principales mediadores inflamatorios y del colágeno, la composición de la microbiota oral en el líquido crevicular gingival (GCF) y la tomografía computarizada de haz cónico (CBCT) para medir la pérdida ósea alveolar. Los resultados mostraron que los tratamientos con MIM no podían reducir significativamente la inflamación, la degradación del colágeno ni la pérdida ósea alveolar. No obstante, este estudio puso de manifiesto el potencial de los ULD RANTES para modular la microbiota oral, lo que indica un posible impacto positivo al promover un perfil bacteriano más saludable.

Por último, se investigó el potencial de MIM-seq en un modelo de rata ovariectomizada (OVX) de osteoporosis posmenopáusica. El tratamiento MIM-seq se evaluó en dos condiciones: como tratamiento preventivo para la osteoporosis en fase inicial inmediatamente después de la OVX, y como intervención terapéutica para la osteoporosis establecida, administrada dos meses después de la OVX. El estudio evaluó la composición corporal, los marcadores bioquímicos plasmáticos del recambio óseo y la calidad del hueso mediante pruebas mecánicas y microtomografía computarizada (micro-CT) del hueso trabecular. Los resultados demostraron que el tratamiento con MIM-seq mejoró la resistencia ósea y redujo los marcadores de resorción ósea en el modelo de osteoporosis en fase inicial. Sin embargo, en el modelo de osteoporosis establecida, aunque el tratamiento redujo significativamente el biomarcador CTX-I, no se observó ninguna mejora significativa en la calidad del hueso.

En conclusión, aunque los MIM estudiados demostraron in vitro una buena biocompatibilidad y algunos efectos antiinflamatorios y potenciadores del metabolismo del colágeno, su eficacia in vivo requiere más investigación. En conjunto, los resultados derivados de esta tesis han explorado por primera vez la biocompatibilidad y la eficacia preclínica de estos MIM en el contexto de la periodontitis y la osteoporosis, ofreciendo nuevas perspectivas para futuras estrategias terapéuticas.