Caracterització molecular dels efectes de la inhibició de l'EGFR en cèl·lules de Glioma

Abstract

[cat] Els Gliomes són els tumors primaris del SNC més freqüents i malignes, amb una supervivència mitjana aproximadament d’un any després del diagnòstic. Es caracteritzen per una proliferació cel·lular descontrolada, infiltració difusa del teixit adjacent, focus de necrosi, elevada angiogènesi i una gran resistència a l’apoptosi, a més d’elevada inestabilitat cromosòmica. A tot això cal afegir-hi el fet que són tumors altament resistents a la majoria dels protocols terapèutics establerts i que a través de procediments quirúrgics i degut a la seva natura infiltrant no és possible la seva exèresi completa. Així, tots els tractaments actuals només són capaços d’oferir millores temporals i limitades. En aquest treball s’ha estudiat els efectes d’un fàrmac inhibidor de l’EGFR, l’erlotinib (Tarceva®), sobre una de les característiques principals dels gliomes: la motilitat i la capacitat d’invasió. El tractament amb erlotinib provoca una disminució de la motilitat i la invasió en línies cel·lulars de glioma i en cèl·lules que sobreexpressen el reeceptor d’EGF o que presenten la mutació activadora EGFR∆vIII. Aquests efectes es porten a terme a través de la modulació del balanç de l’activitat de les RhoGTPases Rac1 i RhoA, disminuint l’activitat de la primera i augmentant l’activació de RhoA, cosa que porta a la formació de fibres d’estrès i adhesions focals dependent de Rho/ROCK, inhibint la motilitat i la invasió de les cèl·lules de glioma. El tractament, a més, produeix la disminució de l’expressió de la RhoGTPasa atípica RhoE, que és inhibidora de RhoA. A banda s’ha analitzat el paper que tenen els factors de transcripció FOXO i FOXM en la resposta a l’erlotinib, i s’ha valorat la reactivació de FOXO com a estratègia terapèutica per al tractament dels gliomes. El tractament de les cèl·lules de glioma amb erlotinib, a través de la inhibició de la via de senyalització PI3K/Akt produeix una activació del factor de transcripció FoxO3a, acumulant-se al nucli i provocant la modulació de les seves dianes transcripcionals directes, com p27KIP1, FOXO1 (activació), Ciclina D1 o FOXM1 (repressió), que porta a una disminució de la viabilitat cel·lular. L’expressió d’una proteïna FOXO3a constitutivament activa, FoxO3a(A3), juntament amb el tractament amb erlotinib, fa que la viabilitat de les cèl·lules sigui molt menor que amb el tractament sol o amb l’expressió de la proteïna mutada sense tractament. Això fa pensar que la reactivació de FOXO pot suposar un camp terapèutic interessant per al tractament dels gliomes. Per això es va utilitzar un inhibidor de l’export nuclear de FOXO1 (diana transcripcional directa de FOXO3a) en combinació amb erlotinib. Aquest és el fàrmac antipsicòtic trifluoperazina, d’ús habitual en tractaments psiquiàtrics. Així , la combinació dels dos tractaments mostra efectes clarament additius en les línies LN229 i T98G, mentre que a la línia U373 té un efecte sinèrgic evident. A més, aquests tractaments, per sí mateixos no indueixen l’apoptosi a través de l’activació de les caspases, mentre que en les cèl·lules tractades amb la combinació dels dos si que es dona mort cel·lular per apoptosi. Aquests efectes cel·lulars són modulats a través dels factors de transcripció FOXO3a i FOXO1, ja que la depleció d’un dels dos reverteix en part els efectes dels tractaments, tant en combinació com per separat. En la resposta a la combinació d’EB i TFP les dues proteïnes són essencials ja que, la manca de les dues fa que no hi hagi pràcticament cap resposta al tractament. La resposta obtinguda a la combinació dels dos fàrmacs fa pensar en una estratè- gia prometedora per al tractament dels gliomes, i el fet que ambdós siguin tractaments usats habitualment pot fer més senzilla la seva translació a la pràctica clínica. Cal però seguir desenredant els mecanismes implicats en la resposta.

[spa] Los gliomas son los tumores del SNC más frecuentes y malignos, con una supervivencia media aproximadamente de un año después de su diagnóstico. Este tipo de tumor se caracteriza por una proliferación celular descontrolada, infiltración difusa del tejido adyacente, focos de necrosis, elevada angiogénesis i una gran resistencia a la apoptosis, además de elevada inestabilidad cromosómica. A todo el conjunto se le debe añadir el hecho que son tumores altamente resistentes a la mayoría de protocolos terapéuticos establecidos y que, a través de procedimientos quirúrgicos y debido a su naturaleza infiltrante no es posible la exéresis completa de la neoplasia. Los tratamientos actuales sólo son capaces de ofrecer mejoras limitadas y temporales. En el presente trabajo se han estudiado los efectos de un fármaco inhibidor del EGFR, el erlotinib (Tarceva® ), sobre una de las características principales de los gliomas: la motilidad y la capacidad de invasión. Se ha visto como el tratamiento con erlotinib provoca una disminución de la motilidad y la invasión en líneas celulares de glioma, así como en células que sobreexpresan el receptor del EGF o que presentan una mutación activadora, EGFR∆vIII. Estos efectos se llevan a cabo a través de la modulación del balance de la actividad de las RhoGTPasas Rac1 y RhoA, disminuyendo la actividad de la primera y aumentando la actividad de RhoA, lo cual lleva a una formación de fibras de estrés i adhesiones focales dependiente de Rho/ROCK, inhibiendo la motilidad y la invasión de las células de glioma. El tratamiento, además produce una inhibición de la RhoGTPasa atípica RhoE, proteína que inhibe a RhoA. A parte se ha analizado el papel que ejercen los factores de transcripción FOXO i FOXM en la respuesta al inhibidor del EGFR erlotinib, y se ha valorado la reactivación de FOXO como estrategia terapéutica para el tratamiento de los gliomas. El tratamiento de células de glioma con erlotinib, a través de la via de señalización PI3K/Akt produce una activación del factor de transcripción FoxO3a, acumulándose en el núcleo i provocando la activación o la represión de sus dianas transcripcionales directas, como p27KIP1, FOXO1 (activación), Ciclina D1 o FOXM1 (represión), que lleva a una disminución de la viabilidad cel·lular. La expresión de una proteína FOXO3a constitutivamente activa, FoxO3a(A3), juntamente con el tratamiento con erlotinib, hace que la viabilidad de las células sea mucho menor que con el tratamiento solo o con la expresión de la proteína mutada sin tratamiento. Esto lleva a o pensar que la reactivación de FOXO puede suponer un campo terapéutico interesante para el tratamiento de los gliomas. Por este motivo se utilizó un inhibidor del exporte nuclear de FOXO1 (diana transcripcional directa de FOXO3a) en combinación con erlotinib. Este es el fármaco antipsicótico trifluoperazina, de uso habitual en tratamientos psiquiátricos. La combinación de los dos tratamientos muestra efectos claramente aditivos en las líneas LN229 i T98G, mientras que en la línea U373 tiene un efecto sinérgico evidente. Además, los tratamientos por si solos no inducen apoptosis a través de la activación de las caspasas, minetras que en las células tratadas con la combinación si que se observa la muerte celular por apoptosis. Estos efectos celulares se modulan a través de los factores de transcripción FOXO3a i FOXO1, ya que la depleción de uno de los dos revierte, en parte, los efectos de los tratamientos, tanto por separado como en combinación. En la respuesta a la combinación del EB y la TFP las dos proteínas son esenciales, ya que la depleción de las dos revierte completamente la respuesta al tratamiento. La respuesta obtenida hace pensar en una estrategia prometedora para el tratamiento de los gliomas y, el hecho que los dos sean de uso habitual puede facilitar su traslación a la practica clínica. Por eso hay que seguir dsesenredando los mecanismos implicados en la respuesta.

[eng] Malignant gliomas are the most frequent CNS primary tumours and are amongst the most aggressive human cancers, with a 15-months median survival upon diagnosis. They are characterized by diffuse infiltration, necrosis, angiogenesis and resistance to apoptosis. In addition, gliomas are resistant to most established therapeutic protocols and due to their invasiveness, surgical resection of tumours is usually incomplete. Here we have studied the impact of EGFR inhibition with erlotinib on the hallmark feature of gliomas: increased motility and invasion. Erlotinib-treated cells, including cells with overexpressed or mutated EGFR, show a decrease in motility and invasion rates. These effects are mediated through modulation of the activity of Rho-GTPases, since erlotinib induces Rac1 inhibition and RhoA activation, leading to a Rho/ROCK-dependent increase in actomyosin contractility which correlates with an observed decrease in RhoE expression in response to erlotinib. The role of FOXO/FOXM transcription factors has also been analyzed in response to erlotinib. Erlotinib inhibits PI3K/Akt signalling and activates FoxO3a, inducing its nuclear accumulation and altering the expression levels of its major transcriptional targets, leading to a decrease in cell viability. Constitutively-active FoxO3a mutant expression cooperates with erlotinib to further decrease cell viability. This suggests that FOXO reactivation could be a promising therapeutic strategy for glioma treatment, and proof-of-concept experiments were performed using the FOXO nuclear export inhibitor trifluoperazine (TFP, a widely-used antipsychotic agent). TFP induces FOXO1 activation and its nuclear accumulation, thus inhibiting glioma cell viability. The addition of TFP to erlotinib treatment clearly potentiates its effects in an additive/synergistic manner (depending on the cell line). Neither erlotinib nor TFP alone induce apoptosis, but their combination strongly induces caspase activation and cell death. Importantly, FOXOs mediate these cellular effects, since FOXO1 or FOXO3a depletion partially reverse the effects of the combination treatment, and double FOXO1/FOXO3a-depleted cells are completely insensitive to this treatment. These results highlight the potential of this pharmacological combination for glioma treatment, although further work is still required to unravel the molecular mechanisms implicated in their cellular effects.