Establishing a safe harbor site for the introduction of genetic information in the human cells by the recombination system attP/attB

Show simple item record

dc.contributor.author Palomino Lago, Esther
dc.date 2018
dc.date.accessioned 2019-03-25T08:34:09Z
dc.date.available 2019-03-25T08:34:09Z
dc.date.issued 2019-03-25
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11201/149161
dc.description.abstract [eng] The goal of this project is to generate a safe harbor site in the genome of human cells, where information could be specifically inserted without the action of nucleases. The mechanism that we present here is based on two different sitespecific recombinases phiC31 and Bxb1, as well as on the piggyBack and Sleeping Beauty transposons. Recombinase phiC31 is an integrase used by phages to establish the lysogenic life cycle. During integration, phiC31 drives recombination between the attP and the attB attachment sites on the phage and host genome, respectively. In naturally occurring phage infestations, the end result is an integrated phage genome flanked by new attL and attR sites, generated by recombination of the original, attP and attB sites. In our system, the phage genome is substituted by the acceptor sites that will constitute the core of the safe harbor locus. Under inducing conditions, the phage genome is excised via integrase-mediated recombination between attL and attR regenerating the attP and attB attachment sites. This action is directed by PhiC31 in the presence of an accessory protein (the recombination directionality factor, RDF). The alternative use of phiC31, alone or together with RDF, allows for the indefinite repetition of the cycle and the subsequent incorporation into the targeted locus of as many attachment sites as needed. The whole mechanism is made possible by the coordinated and alternative use of piggyBac and Sleeping Beauty transposons that, at each step, remove residual DNA fragments (plasmid sequences, selection elements, etc.). Once the final configuration of the safe harbor locus is reached, the Bxb1 recombinase is used to upload the desired genetic information: markers, therapeutic genes, inducible system or even complete regulatory routes. ca
dc.description.abstract [spa] El objetivo principal de este proyecto es generar una plataforma de carga segura dentro del genoma de células humanas, donde la información pueda ser insertada de forma específica sin la necesidad de usar nucleasas. De este modo se reduciría la posibilidad de integraciones azarosas y se aumentaría la eficiencia de integración. Para este fin, el mecanismo propuesto en la presente Tesis Doctoral combina el uso de dos recombinasas diferentes, phiC31 y Bxb1, así como de los sistemas de transposición piggyBac y Sleeping Beauty. La recombinasa phiC31 es una integrasa encargada de la incorporación del ADN de fagos en el hospedador durante el ciclo lisogénico. La integración se realiza mediante recombinación entre dos sitios de unión específicos, attP presente en el fago y attB localizado en el genoma del hospedador. Durante el proceso de infección el genoma del fago queda integrado en el genoma del hospedador y flanqueado por dos nuevos sitios de reconocimiento específico, attL y attR, generados a partir de la recombinación de las secuencias originales, attP y attB. En nuestro sistema, el genoma del fago es sustituido por los sitios de carga que constituirán el núcleo de la plataforma de integración. Bajo condiciones de inducción el genoma del fago puede eliminarse del sitio de integración mediante recombinación entre los sitios attL y attR, regenerándose en el proceso los sitios attB y attP originales. Esta reacción inversa la cataliza phiC31 en presencia de una proteína accesoria denominada Factor de Direccionalidad de la Recombinación (RDF, por sus siglas en inglés). El uso alternativo de phiC31 sola o en combinación con RDF, hace posible la repetición indefinida del ciclo de carga y la consiguiente incorporación al locus genómico elegido de tantos sitios de recombinación como se consideren necesarios. El ensamblaje completo de la plataforma se consigue mediante el uso coordinado y alternativo de los transposones piggyBac y Sleeping Beauty que permite en cada paso la eliminación de los fragmentos de ADN no deseados (secuencias del plásmido, elementos de selección, etc.). Una vez constituida la plataforma de carga, la recombinasa Bxb1 es la responsable de mediar la carga de la información genética deseada: marcadores, genes terapéuticos, sistema inducible o incluso rutas regulatorias completas. ca
dc.description.abstract [cat] L’objectiu principal d’aquest projecte és generar una plataforma de càrrega segura dins el genoma, en cèl·lules humanes, on la informació pugui ser inserida de manera específica i sense necessitat d’usar nucleases. D’aquesta manera es reduiria la possibilitat d’integracions degudes a l’atzar i s’augmentaria l’eficiència d’integració. Amb aquest finalitat, el mecanisme proposat en la present Tesi doctoral combina l’ús de dues recombinases diferents, phiC31 i Bxb1, així com dels transposons piggyBac i Sleeping Beauty. La recombinasa phiC31 és una integrasa encarregada de la incorporació de l’ADN de fags a l’hoste durant el cicle lisogènic. Aquesta integració es realitza mitjançant la recombinació entre dos llocs d’unió específics, attP present en el fag i attB localitzat en el genoma de l’hoste. Durant el procés d’infecció el genoma del fag queda integrat en el genoma de l’hoste i flanquejat per dos llocs de reconeixement específic nous, attL i attR, generats a partir de la recombinació de les seqüències originals, attP i attB. En el nostre sistema, el genoma del fag és substituït pels llocs de càrrega que constituiran el nucli de la plataforma d'integració. Sota condicions d'inducció el genoma del fag pot eliminar del lloc d'integració mitjançant recombinació entre els llocs attL i attr, regenerant-se en el procés els llocs attB i attP originals. Aquesta reacció inversa la catalitza phiC31 en presència d'una proteïna accessòria anomenada Factor de Direccionalitat de la Recombinació (RDF, per les sigles en anglès). L'ús alternatiu de phiC31 sola o en combinació amb RDF, fa possible la repetició indefinida del cicle de càrrega i la consegüent incorporació al locus genòmic triat de tants llocs de recombinació com es considerin necessaris. L'acoblament complet de la plataforma s'aconsegueix mitjançant l'ús coordinat i alternatiu dels transposons piggyBac i Sleeping Beauty que permet a cada pas l'eliminació dels fragments d'ADN no desitjats (seqüències del plàsmid, elements de selecció, etc.). Un cop constituïda la plataforma de càrrega, la recombinasa Bxb1 és emprada per a la càrrega d'informació genètica desitjada: marcadors, gens terapèutics, sistemes induïble o inclús rutes reguladores completes. ca
dc.format application/pdf
dc.format.extent 164 ca
dc.language.iso eng ca
dc.publisher Universitat de les Illes Balears
dc.rights all rights reserved
dc.rights info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.subject.other CCR5 locus, Homologous recombination, TALENs, Genome editing, Recombinases, PhiC31, Bxb1, Genome engineering, Transposase, PiggyBac, Sleeping beauty, Attachment sites, Integration, Endonuclease, Transposon, Integrase, HeLa cells, HiPS cells ca
dc.subject.other CCR5 locus, Recombinación homóloga, TALENs, Edición genómica, Recombinasa, PhiC31, Bxb1, Ingeniería genómica, Transposasa, PiggyBac, Sleeping beauty, Sitio de unión, Integración, Endonucleasa, Transposon, Integrasa, Células HeLa, Células hiPS ca
dc.subject.other CCR5 locus, Recombinació homòloga, TALENs, Edicó génica, Recombinasa, PhiC31, Bxb1, Enginyeria genómica, Transposasa, PiggyBac, Sleeping Beauty, Lloc d’unió, Integració, Endonucleasa, Transposon, Integrasa, Cèl·lula Hela, Cèl·lula hiPS ca
dc.title Establishing a safe harbor site for the introduction of genetic information in the human cells by the recombination system attP/attB ca
dc.type info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
dc.type info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.subject.udc 57 - Biologia ca
dc.subject.udc 576 - Biologia cel·lular i subcel·lular. Citologia ca
dc.subject.udc 61 - Medicina ca
dc.subject.ac Ciencias de la salud ca
dc.contributor.director Bachiller Pérez, Daniel
dc.contributor.codirector Fleischer, Aarne
dc.contributor.tutor García, Julia


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search Repository


Advanced Search

Browse

My Account

Statistics