Paper biosensors for the rapid diagnosis of infections and sepsis using plasmonic nanoparticles

Abstract

[spa] Los biosensores colorimétricos de papel basados en nanotecnología son adecuados para realizar mediciones en el punto de atención, ya que el papel es flexible, absorbente, económico, liviano y se puede desechar fácilmente. Las nanopartículas de oro (AuNPs) son el material generalmente empleado para producir las señales colorimétricas observadas en estos sensores. Esto es debido a que exhiben colores intensos ya que presentan un alto coeficiente de extinción molar. Una limitación en el uso de AuNPs es la dificultad para lograr la amplificación de la señal, ya que la señal depende únicamente del coeficiente de extinción de las nanopartículas y del número de interacciones específicas con el analito objetivo. Otra limitación, es que, una vez secas, las nanopartículas tienden a adsorberse de forma irreversible a los sustratos de papel, lo que dificulta su almacenamiento en este material. En esta tesis doctoral se desarrolló una nueva y versátil tecnología que permite superar las limitaciones de los biosensores de papel tradicionales. Para lograrlo, primero se optimizaron algunos aspectos claves de la fabricación, esto incluyó la ejecución de tres métodos de síntesis de AuNPs, tales como la reducción de iones de oro con citrato, poli(clorhidrato de alilamina) PAH o polivinilpirrolidona (PVP). Luego, las AuNPs se cubrieron con grupos carboxilo, amino, o polivinilpirrolidona (PVP), respectivamente, para posteriormente ser modificadas con proteínas a través de 3 vías. Las mejores condiciones obtenidas de los experimentos anteriores se aplicaron para la detección en PBS del biomarcador de sepsis interleuquina 6 (IL-6), obteniendo un límite de detección (LOD) de 0,1 pg·mL-1. En segundo lugar, se desarrolló un inmunosensor ultrarrápido fabricado completamente en papel. Este dispositivo implementa un nuevo diseño basado en reservorios que almacenan AuNPs decoradas con anticuerpos en papel de filtro. Esto se logró modificando el papel de filtro con el polímero de carga negativa poliestireno sulfonato (PSS). Las nanopartículas en el reservorio se pueden transferir con gran eficacia a un papel húmedo receptor que contiene el analito. Una vez transferidas, las AuNPs mantienen su color y su función de biorreconocimiento. Para probar este método, se integró este reservorio en biosensores de papel para la detección de la glicoproteína B del citomegalovirus humano añadido a muestras de suero. Posteriormente, utilizando el mismo diseño, se detectó el patógeno Pseudomonas aeruginosa (PA), en solo 8 min con un límite de detección en PBS de 105 células·mL−1, que es el valor umbral clínico para diagnosticar una infección. Como resultado, fue posible diferenciar las muestras positivas para PA de las muestras negativas, de las muestras con flora mixta e incluso de las muestras positivas para otros patógenos productores de catalasa. Finalmente, el implementar el nuevo diseño con el reservorio, permitió mejorar los resultados obtenidos con los primeros biosensores que detectaban IL-6. En primer lugar, el tiempo de ensayo se redujo por debajo de los 10 min y, en segundo lugar, el LOD disminuyó hasta 10−3 pg·mL-1. Adicionalmente, se adquirieron medidas semicuantitativas en un amplio rango dinámico entre 10−3 y 102 pg·mL-1 en PBS. Debido al LOD tan bajo de este inmunosensor, las muestras de sangre y BAS de pacientes con COVID-19 se pudieron diluir entre 100 y 1000 veces para minimizar las interferencias de la matriz. Con los resultados obtenidos, los pacientes fueron estratificados según la gravedad. Las señales colorimétricas de los biosensores se pueden ver y analizar a simple vista, fotografiando el papel o con una aplicación móvil de densitometría desarrollada en nuestro laboratorio (convirtiendo a nuestros biosensores en una herramienta semicuantitativa). Los biosensores desarrollados son una plataforma analítica completa, muy adecuada para mediciones varios entornos de atención médica y útil para la identificación de posibles casos de sepsis.

[eng] Nanotechnology-based colorimetric paper biosensors are suitable for point-of-care measurements, as paper is flexible, absorbent, inexpensive, lightweight, and can be easily disposed of. Gold nanoparticles (AuNPs) are the material generally used to produce the colorimetric signals observed in these sensors. This is because they exhibit intense colors and have a high molar extinction coefficient. A limitation in the use of AuNPs is the difficulty in achieving signal amplification, since the signal depends only on the extinction coefficient of the nanoparticles and the number of specific interactions with the target analyte. Another limitation is that, once dry, the nanoparticles tend to irreversibly adsorb to paper substrates, which makes it difficult to store them in this material. In this doctoral thesis, a new and versatile technology was developed that allows overcoming the limitations of traditional paper biosensors. To achieve this, some key aspects of the fabrication were first optimized, this included the execution of three methods of synthesis of AuNPs, such as the reduction of gold ions with citrate, poly(allylamine hydrochloride) PAH or polyvinylpyrrolidone (PVP). The AuNPs were then capped with carboxyl, amino, or polyvinylpyrrolidone (PVP) groups, respectively, to be subsequently protein-modified through 3 pathways. The best conditions obtained from the previous experiments were applied for the detection in PBS of the sepsis biomarker interleukin 6 (IL-6), obtaining a limit of detection (LOD) of 0.1 pg·mL-1. Second, an ultrafast immunosensor made entirely of paper was developed. This device implements a new design based on reservoirs that store antibody-decorated AuNPs on filter paper. This was achieved by modifying the filter paper with the negatively charged polymer polystyrene sulfonate (PSS). The nanoparticles in the reservoir can be transferred with high efficiency to a wet receptor paper containing the analyte. Once transferred, the AuNPs maintain their color and biorecognition function. To test this method, this reservoir was integrated into paper biosensors for the detection of human cytomegalovirus glycoprotein B added to serum samples. Subsequently, using the same design, the pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA) was detected in only 8 min with a detection limit in PBS of 105 cells·mL−1, which is the clinical threshold value for diagnosing an infection. As a result, it was possible to differentiate PA-positive samples from negative samples, from samples with mixed flora, and even from samples positive for other catalase-producing pathogens. Finally, implementing the new design with the reservoir made it possible to improve the results obtained with the first biosensors that detected IL-6. First, the assay time was reduced below 10 min, and second, the LOD decreased to 10−3 pg mL-1. Additionally, semiquantitative measurements were acquired in a wide dynamic range between 10−3 and 102 pg·mL-1 in PBS. Due to the very low LOD of this immunosensor, blood and BAS samples from COVID-19 patients could be diluted 100- to 1000-fold to minimize matrix interferences. With the results obtained, the patients were stratified according to severity. The colorimetric signals of the biosensors can be seen and analyzed with the naked eye, by photographing the paper or with a mobile densitometry application developed in our laboratory (turning our biosensors into a semi-quantitative tool). The developed biosensors are a complete analytical platform, very suitable for measurements in various healthcare settings and useful for the identification of possible cases of sepsis.