[eng] Introduction: Pseudomonas aeruginosa is a major opportunistic pathogen and a leading cause of
severe nosocomial pneumonia and sepsis. Surfactant proteins and the complement system play a
critical role in the host defense against P. aeruginosa infections. Nevertheless, the bacterial targets of
the surfactant protein A (SP-A), the major surfactant protein in the lung, and the component C3, the
central component of the complement system, remain poorly investigated. The objectives of this study
were; i) to characterize the interaction between SP-A and a collection of chronic isogenic sequential
isolates from cystic fibrosis (CF) patients to identify the SP-A-binding molecules of P. aeruginosa and
the mechanism adopted by these isolates to resist the SP-A mediated clearance and ii) to identify
novel C3 binding molecules of P. aeruginosa as well as to characterize new strategies that this
pathogen uses to elude the complement system effects.
Research content: To achieve the first objective, we used a combination of in vitro approaches,
including binding assays with human purified SP-A, mass spectrometry analysis, genetic loss of
function/gain of function of selected bacterial genes and phagocytosis assays with human
macrophages. We characterized the interplay between SP-A and a collection of isogenic sequential
isolates from seven CF patients. We identified outer membrane protein OprH as a novel ligand for SPA
on P. aeruginosa. Late isolates from CF patients bound significantly less SP-A than their respective
early isolates. This difference could be associated with a reduction in the expression of OprH. Binding
of SP-A to OprH promoted phagocytic killing, thus late isolates from CF patients were at least two-fold
more resistant to SP-A mediated killing by human macrophages than their respective early isolates.
Our second objective, the identification of novel P. aeruginosa C3 binding molecules, arose from a
study originally designed to investigate the role of PhoQ in P. aeruginosa bloodstream infections. We
observed that a PhoQ-deficient mutant was avirulent in a murine model of systemic infection and did
not cause bacteremia. In the presence of blood concentrations of Mg2+, a PhoQ mutant bound more
C3 and was more susceptible to complement-mediated opsonophagocytosis than the parent strain,
suggesting a direct effect of the Mg2+ on the modulation of expression of a bacterial component by the
PhoP/PhoQ system. Ligand blot analysis, C3 binding experiments and opsonophagocytosis assays
identified this component as the outer membrane protein OprH.
Conclusion: We have shown that OprH is a novel P. aeruginosa SP-A-acceptor molecule on CF
isolates. We postulate that reduction of OprH expression is a previously unrecognized adaptation of P.
aeruginosa to CF lung that facilitates the escape of the microorganism from the SP-A-mediated
phagocytic killing. Moreover, this study identifies PhoQ as an essential Mg2+ sensor for P. aeruginosa
to avoid complement-mediated opsonophagocytosis due to the direct control that exerts on the
expression of OprH, a previously unrecognized C3 binding molecule of P. aeruginosa.
[spa] Introducción: Pseudomonas aeruginosa es uno de los principales patógenos causantes de
neumonía nosocomial grave y sepsis. Las proteínas surfactantes y el sistema del complemento
juegan un papel crítico en la defensa del huésped frente a las infecciones por P. aeruginosa. Sin
embargo, las dianas bacterianas de la proteína surfactante A (PS-A), la principal proteína surfactante
del pulmón, y de C3, el componente central del sistema del complemento, no han sido investigadas
adecuadamente. Los objetivos de este estudio fueron: i) caracterizar la interacción entre la PS-A y
una colección de aislados crónicos isogénicos de pacientes con fibrosis quística (FQ) para identificar
las moléculas de unión de la PS-A en P. aeruginosa y el mecanismo adoptado por estos aislados
para resistir la muerte mediada por la PS-A e ii) identificar nuevas moléculas de P. aeruginosa que
unen C3, así como también caracterizar las estrategias que este patógeno utiliza para evadir los
efectos del sistema del complemento.
Contenido de la investigación: Para alcanzar el primer objetivo, se utilizó una combinación de
distintas aproximaciones metodológicas in vitro incluyendo ensayos de unión con PS-A humana
purificada, análisis de espectrometría de masas, pérdida genética de función / ganancia de función de
genes bacterianos seleccionados y ensayos de fagocitosis con macrófagos humanos. Se caracterizó
la interacción entre la PS-A y una colección de aislamientos secuenciales isogénicos de siete
pacientes con FQ. Se identificó la proteína de membrana externa OprH como un nuevo ligando de
PS-A en P. aeruginosa. Los aislados tardíos unieron significativamente menos PS-A que los
aislamientos isogénicos tempranos, respectivos. Esta diferencia pudo asociarse a una reducción en la
expresión de OprH. La unión de PS-A a OprH facilitó la eliminación de P. aeruginosa por fagocitosis.
De esta forma, los aislados tardíos fueron al menos dos veces más resistentes a la eliminación por
fagocitosis mediada por PS-A que sus aislados tempranos respectivos. La identificación de nuevas
moléculas de P. aeruginosa que unen C3 surgió como resultado de un estudio diseñado para
investigar el papel de PhoQ en las bacteremias causadas por P. aeruginosa. Se observó que un
mutante deficiente en PhoQ era avirulento en un modelo murino de infección sistémica y no causaba
bacteriemia. En presencia de concentraciones sanguíneas de Mg2+, el mutante en PhoQ unió más C3
y fue más susceptible a la opsonofagocitosis mediada por el complemento que la cepa parental, lo
que sugería un efecto directo del Mg2+ sobre la modulación de la expresión de un componente
bacteriano por el sistema PhoP/PhoQ. Los experimentos de unión a C3 y los ensayos de
opsonofagocitosis identificaron a este componente como la proteína de membrana externa OprH.
Conclusión: OprH es una nueva diana para la unión de PS-A en los aislados de P. aeruginosa de
pacientes con FQ. La reducción de la expresión de OprH es una adaptación, previamente
desconocida, que P. aeruginosa adopta en el pulmón con FQ para evadir la eliminación por la
fagocitosis mediada por la PS-A. Hemos identificado a PhoQ como un sensor de Mg2+ esencial para
que P. aeruginosa evite la opsonofagocitosis mediada por el complemento debido al control directo
que ejerce sobre la expresión de OprH, una diana de C3, previamente desconocida, en P.
aeruginosa.
[cat] Introducció: Pseudomonas aeruginosa és un dels principals patògens causants de pneumònia
nosocomial greu i sèpsia. Les proteïnes surfactants i el sistema del complement juguen un paper crític
en la defensa de l'hoste enfront de les infeccions per P. aeruginosa. Malgrat això, les dianes
bacterianes de la proteïna surfactant A (PS-A), la principal proteïna surfactant del pulmó, i de C3, el
component central del sistema del complement, no s'han investigat adequadament. Els objectius
d'aquest estudi van ser: i) caracteritzar la interacció entre la PS-A i una col·lecció d'aïllats crònics
isogènics de pacients amb fibrosis quística (FQ) per identificar les molècules d'unió de PS-A a P.
aeruginosa i el mecanisme adoptat per aquests aïllats per resistir la mort mediada per la PS-A i ii)
identificar noves molècules de P. aeruginosa que uneixen C3, així com caracteritzar les estratègies
que aquest patogen utilitza per evadir els efectes del sistema del complement.
[cat] Contingut de la recerca: Per aconseguir el primer objectiu, es va utilitzar una combinació de
diferents aproximacions metodològiques in vitro incloent assajos d'unió amb PS-A humana purificada,
anàlisi d'espectrometria de masses, pèrdua genètica de funció / guany de funció de gens bacterians
seleccionats i assajos de fagocitosis amb macròfags humans. Es va caracteritzar la interacció entre la
PS-A i una col·lecció d'aïllaments seqüencials isogènics de set pacients amb FQ. Es va identificar la
proteïna de membrana externa OprH com un nou lligant de la PS-A a P. aeruginosa. Els aïllats finals
van unir significativament menys PS-A que els aïllaments isogènics inicials, respectius. Aquesta
diferència va poder associar-se a una reducció en l'expressió de OprH. La unió de PS-A a OprH va
facilitar l'eliminació per fagocitosi de P. aeruginosa. D'aquesta forma, els aïllats finals van ser almenys
dues vegades més resistents a l'eliminació per fagocitosi mediada per la PS-A que els aïllats originals
respectius. La identificació de noves molècules de P. aeruginosa que uneixen C3 va sorgir com a
resultat d'un estudi originalment dissenyat per investigar el paper de PhoQ en les bacteremias
causades per P. aeruginosa. Es va observar que un mutant deficient en PhoQ era avirulent en un
model murí d'infecció sistémica i no causava bacteriemia. En presència de concentracions sanguínies
de Mg2+, el mutant de PhoQ va unir més C3 i va ser més susceptible a l'opsonofagocitosis mediada
pel complement que la soca parental, la qual cosa suggeria un efecte directe del Mg2+ sobre la
modulació de l'expressió d'un component bacterià pel sistema PhoP/PhoQ. Els experiments d'unió de
C3 i els assajos d'opsonofagocitosis van identificar a aquest component com la proteïna de
membrana externa OprH.
Conclusió: OprH és una nova diana per a la unió de PS-A en els aïllats de P. aeruginosa de pacients
amb FQ. La reducció de l'expressió de OprH és una adaptació, prèviament desconeguda, que P.
aeruginosa adopta en el pulmó amb FQ per evadir l'eliminació per la fagocitosi mediada per la PS-A.
Hem identificat a PhoQ com un sensor de Mg2+ essencial per a que P. aeruginosa eviti
l'opsonofagocitosis mediada pel complement a causa del control directe que exerceix sobre
l'expressió de OprH, una diana de C3, prèviament desconeguda, en P. aeruginosa.