Proteogenomic and physiologic characterization of new members of Roseobacter lineage from Mallorca harbors

Abstract

[eng] The Roseobacter lineage is an important component of marine bacterioplankton. One of the characteristics of roseobacters is their ability to degrade aromatic compounds, but this evidence is supported mainly by genome data from isolates mostly obtained from nonpolluted environments. A collection of Roseobacter isolates from harbors and marinas around Mallorca Island was obtained previously. This was a unique collection of isolates that were obtained from polluted environments, same sampling time, and same geographic area. We hypothesized that these bacteria would differ from other roseobacters in their ability to degrade aromatic compounds and in the degree of genetic exchange by horizontal gene transfer (HGT). The genomes of nine of these isolates have been analyzed in this thesis. Genomic data was used to affiliate taxonomically the isolates and to establish their phylogeny within the Roseobacter lineage. A core genome phylogenetic analysis based on concatenated sequences of 114 proteins encoded in single copy core genes was done (ninety-six genomes). A subset of fourteen of these protein sequences was shown to reproduce well the phylogeny of the lineage and it is proposed as a simplified method for the affiliation of new Roseobacter isolates. The isolates showed typical characteristics (genomic and metabolic) of cultured roseobacters, also with respect to potential for aromatic compound degradation. Seven of them were predicted to possess alkane monoxygenase genes, and three were able to grow on diesel oil as sole carbon and energy source. Proteomic analysis was used to study the response of the isolates to diesel oil exposure. Alkane monooxygenase was detected in three isolates, including two of the isolates able to grow on diesel oil. Proteins involved in maintaining membrane stability, response to oxidative stress, chaperones and membrane transport were detected in cultures exposed to diesel oil, although there were differences in the response of the particular isolates. These results indicated that roseobacters had the basic mechanisms described to respond to hydrocarbons. Finally, three mechanisms of HGT (gene transfer agents, plasmid replicons and transposable elements) were analyzed in a dataset of 96 genomes. At least one of the HGT mechanisms was detected in all genomes except in isolate HTCC2255, considered an example of streamlined genome similar to uncultured representatives of the lineage. Transposases and plasmid replicons were the most widespread HGT mechanisms. There were differences in the number, size and type of plasmid replicons in genomes from the different phylogenomic groups. Phylogeny of RepC replicase of RepABC plasmids evidenced that this type of plasmids have been exchanged promiscuously among roseobacters. Finally, the analysis of shared transposases showed a high degree of connection in the global network but no clear patterns in relation to phylogenomic relatedness, habitat or geographic place of isolation. These findings support the high genetic diversity and genomic plasticity of cultured representatives of the lineage, and a possible difference with uncultured ones.

[spa] El linaje Roseobacter es un componente importante del bacterioplancton marino. Una de sus características es su capacidad para la degradación de compuestos aromáticos, pero esta evidencia se sustenta principalmente en datos genómicos de aislamientos obtenidos generalmente de ambientes no contaminados. En estudios anteriores se obtuvo una colección de aislados de este linaje de puertos deportivos de la isla de Mallorca. Esta colección de aislados es única porque se obtuvieron de ambientes contaminados, en un mismo período de tiempo y en una misma área geográfica. Hipotetizamos que estas bacterias se diferenciarían de los demás roseobacters en su capacidad para la degradación de compuestos aromáticos y en el grado de intercambio genético por transferencia genética horizontal (HGT). En esta tesis se han analizado los genomas de nueve de estos aislados. La información genómica se utilizó para afiliarlos taxonómicamente y para establecer su filogenia dentro del linaje Roseobacter. Se hizo el análisis filogenético del core genoma basado en la concatenación de 114 secuencias de proteínas codificadas en copia única (noventa y seis genomas). Además se mostró que un subconjunto de catorce de las secuencias de estas proteínas reproducía de forma fiel la filogenia del linaje y se propuso como un método simplificado para afiliar nuevos aislados del linaje. Los aislados mostraron las características (genómicas y metabólicas) típicas de los miembros cultivables, también en lo que respecta a la degradación de compuestos aromáticos. En siete de ellos se predijo la presencia de genes para alcano monooxigenasas en los genomas, y tres de ellos fueron capaces de crecer a expensas de diésel como única fuente de carbono y energía. Para estudiar la respuesta a diésel de los aislados se utilizó un análisis proteómico. En tres de los ailados se detectaron alcano monooxigenasas, incluyendo dos de los aislados capaces de crecer a expensas de diésel. Además, en los cultivos expuestos a diésel se detectaron proteínas implicadas en el mantenimiento de la estabilidad de la membrana, la respuesta al estrés oxidativo, chaperonas y el transporte de membrana, aunque hubo diferencias en la respuesta particular de cada aislado. Estos resultados indicaron que los rosobacters tenían los mecanismos básicos descritos para responder a los hidrocarburos. Finalmente, se analizaron tres mecanismos de HGT (agentes de transferencia de genes, replicones de plásmidos y elementos transponibles) en 96 genomas. En todos los genomas excepto el del aislado HTCC2255, considerado un ejemplo de genoma simplificado similar al de los representantes no cultivables del linaje, se detectó al menos uno de los mecanismos de HGT. Se observaron diferencias en el número, tamaño y tipo de replicones de plásmidos en los genomas de los diferentes grupos filogenómicos. La filogenia de la replicasa RepC de los plásmidos RepABC evidenció que este tipo de plásmidos habían sido intercambiados promiscuamente entre roseobacters. Finalmente, el análisis de transposasas compartidas mostró un alto grado de conexión en la red global, pero no se detectaron patrones claros en relación con la proximidad filogenómica, el hábitat o el lugar geográfico de aislamiento. Estos resultados respaldan la gran diversidad genética y plasticidad genómica de los representantes cultivables del linaje y una posible diferencia con los no cultivables.

[cat] El llinatge Roseobacter és un component important del bacterioplàncton marí. Una de les característiques dels roseobacters és la seva capacitat per a la degradació de compostos aromàtics, però aquesta evidència es recolza principalment en dades genòmiques d'aïllaments obtinguts principalment d'ambients no contaminats. En estudis anteriors es va obtenir una col·lecció d'aïllats d’aquest llinatge de ports esportius de l'illa de Mallorcas. Aquesta col·lecció d'aïllats és única perquè s’havien obtingut d'ambients contaminats, en un mateix període de temps i en una mateixa àrea geogràfica. Hipotetizàrem que aquests bacteris es diferenciarien dels altres roseobacters en la seva habilitat per a la degradació de compostos aromàtics i en el seu grau d'intercanvi genètic per transferència genètica horitzontal (HGT). En aquesta tesi s’han analitzat els genomes de nou d'aquests aïllats. La informació genòmica es va utilitzar per afiliar taxonòmicament els aïllats i establir la seva filogènia dins el llinatge Roseobacter. Es va fer l'anàlisi filogenètic del core genoma basat en la concatenació de 114 seqüències de proteïnes codificades en còpia única (noranta-sis genomes). A més, es va mostrar que un subconjunt de seqüències de catorze d'aquestes proteïnes reproduïa de forma fidel la filogènia del llinatge i es va proposar com un mètode simplificat per afiliar nous aïllats del llinatge. Els aïllats tenien les característiques típiques (genòmiques i metabòliques) dels aïllats cultivables del llinatge, també pel que fa a la degradació de compostos aromàtics. A set d'ells es va predir genòmicament la codificació per alcà monooxigenases, i tres d'ells varen ser capaços de créixer a partir de dièsel com a única font de carboni i energia. Per estudiar la resposta dels aïllats a l'exposició de dièsel es va fer una anàlisi proteòmica. A tres dels aïllats es varen detectar alcà monooxigenases, incloent dos dels aïllats capaços de créixer a expenses de dièsel. A més, en els cultius exposats a dièsel es varen detectar proteïnes implicades en el manteniment de l'estabilitat de la membrana, la resposta a l'estrès oxidatiu, xaperones i el transport de membranal, encara que hi va haver diferències en la resposta particular de cada aïllat. Aquests resultats varen indicar que els roseobacters tenien els mecanismes bàsics descrits per respondre als hidrocarburs. Finalment, es varen analitzar tres mecanismes de HGT (agents de transferència de gens, replicons de plasmidis i elements transposables) en 96 genomes. A tots els genomes, excepte el de l'aïllat HTCC2255, considerat un exemple de genoma simplificat similar als representants no cultivables del llinatge, es va detectar almenys un dels mecanismes de HGT. Es van observar diferències en el nombre, mida i tipus de replicons de plasmidis als genomes dels diferents grups filogenòmics. La filogènia de la replicasa RepC dels plasmidis RepABC va evidenciar que aquest tipus de plasmidis havien estat intercanviats promíscuament entre roseobacters. Finalment, l'anàlisi de transposases compartides mostrà un alt grau de connexió a la xarxa global, però no es varen detectar patrons clars en relació amb la proximitat filogenòmica, l’hàbitat o el lloc geogràfic d'aïllament. Aquests resultats recolzen la gran diversitat genètica i plasticitat genòmica dels representants cultivables del llinatge i mostren una possible diferència amb els no cultivables.