Litiasis renal: avances en el estudio de inhibidores de la cristalización y en nuevas herramientas diagnósticas

Abstract

[spa] La litiasis renal es una enfermedad que consiste en la formación de piedras en el interior de los riñones o de las vías urinarias. El diagnóstico de alteraciones metabólicas en los pacientes litiásicos se realiza utilizando la muestra de orina de 24 horas, y el tratamiento de la patología debe ir enfocado necesariamente al tipo de piedra o cálculo que el paciente haya generado. El tratamiento con inhibidores de la cristalización, tales como el citrato, el fitato, o el magnesio, es un buen enfoque y ha demostrado ser eficaz. No obstante, el diagnóstico de la enfermedad litiásica sigue presentando importantes problemas, y también creemos necesario seguir avanzando en el estudio de los inhibidores de la cristalización. A raíz de esta necesidad de seguir mejorando el conocimiento sobre inhibidores de la cristalización, y de mejorar las herramientas diagnósticas, se plantearon los objetivos de esta tesis, que ha derivado en 6 publicaciones y 4 patentes de invención, todas ellas licenciadas a Devicare, S.L., con solicitud de PCT aprobada y extendidas a más de 10 países. El artículo original 1 describe el efecto inhibitorio que tienen las mezclas binarias de los inhibidores más conocidos de la cristalización del oxalato cálcico: magnesio, citrato y fitato. El estudio revela que la mezcla de fitato y magnesio produce un efecto sinérgico en la inhibición de la cristalización del oxalato cálcico, mientras que en los otros dos casos (mezclas de magnesio y citrato, y de fitato y citrato) el efecto es puramente aditivo. El artículo original 2 describe por primera vez un inhibidor de la cristalización del ácido úrico: la teobromina. Esta dimetilxantina, presente en cantidades importantes en el cacao, retrasa de forma muy marcada la cristalización del ácido úrico, además de modificar la morfología de los cristales de ácido úrico generados. Dado que las concentraciones de teobromina ensayadas en el trabajo están dentro de los márgenes que puede haber en orina, su uso podría ser de gran utilidad para los pacientes con litiasis renal úrica. Así, una vez visto el efecto de la teobromina en la cristalización del ácido úrico, nos propusimos poner a punto una metodología analítica para determinar la concentración de teobromina en orina de forma sencilla. El artículo original 3 describe dicho método, basado en cromatografía líquida de alta resolución, acoplado a un sistema de detección ultravioleta. Una vez validado este método, se utilizó para demostrar la relación existente entre el consumo de alimentos que provengan del cacao, y la excreción urinaria de teobromina, en 80 niños sanos. A pesar de que este método es muy sencillo y útil, únicamente nos permitía analizar la concentración de teobromina. Sin embargo, nos pareció relevante poder disponer de un método más amplio, que posibilitara analizar otras metilxantinas (como la cafeína o la teofilina), algunos metabolitos de dichas sustancias, y otrassustancias como la hipoxantina, la xantina y el ácido úrico, que también están implicados que la enfermedad litiásica. Así, en el artículo original 4, utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución acoplado a un espectrómetro de masas de alta resolución, desarrollamos un método rápido que nos permite analizar doce compuestos en orina en un periodo de tiempo de 10 minutos. Otro de los aspectos en los que se ha pretendido avanzar durante el desarrollo de esta tesis es en el de las mejoras de las herramientas diagnósticas. En especial, hemos centrado los esfuerzos en mejorar la medida del pH urinario, un parámetro esencial en la enfermedad litiásica, y en el tipo de muestra de orina utilizada para realizar las medidas del riesgo litógeno urinario. Así, en el artículo original 5 se comparan dos métodos de medición de pH: la tira reactiva, ampliamente utilizada por enfermos litiásicos y en hospitales, y un nuevo dispositivo patentado por el Laboratorio de Investigación en Litiasis Renal. Ambos métodos se comparan con el método de referencia: el pH-metro con electrodo de vidrio. El estudio muestra que la tira reactiva no tiene la precisión suficiente para poder ser utilizada en el ámbito de la litiasis renal, mientras que el nuevo dispositivo es preciso, fácil de usar, y puede ser utilizado por el propio paciente en su casa. Para acabar, en el artículo original 6, se recogieron muestras de orina de 24 horas, que es la de elección para el diagnóstico de alteraciones metabólicas urinarias, en 257 niños y adultos, tanto sanos como litiásicos. Dicha muestra de orina se recogió en dos botes: 12 horas diurna (desde las 8:00 hasta las 20:00) en el primer bote, y 12 horas nocturna (desde las 20:00 hasta las 8:00 del día siguiente) en el segundo. Se estudió el riesgo litógeno urinario mediante la utilización de diferentes fórmulas de riesgo, en ambas muestras de orina, así como en el total de las 24 horas. Los resultados demuestran que las fórmulas de riesgo dan valores más elevados para los pacientes litiásicos que para el grupo control, y además se observa que la orina nocturna tiene los valores de riesgo litógeno más elevados, tanto en niños como en adultos. De este modo, la orina de 12 horas nocturna puede ser una alternativa a la orina de 24 horas para el estudio del riesgo de cristalización en el paciente litiásico.

[cat] La litiasi renal és una malaltia que consisteix en la formació de pedres a l'interior dels ronyons o de les vies urinàries. El diagnòstic d'alteracions metabòliques en pacients litiàsics es realitza utilitzant la mostra d'orina de 24 hores, i el tractament de la patologia ha d'anar enfocat necessàriament al tipus de pedra o càlcul que el pacient hagi generat. El tractament amb inhibidors de la cristal·lització, com ara el citrat, el fitat, o el magnesi, és una bona estratègia terapèutica, i ha demostrat ser eficaç. No obstant això, el diagnòstic de la malaltia litiàsica segueix presentant importants problemes, i també és necessari seguir avançant en l'estudi dels inhibidors de la cristal·lització. Arran d'aquesta necessitat de seguir millorant el coneixement sobre els inhibidors de la cristal·lització, i de millorar les eines diagnòstiques, es van plantejar els objectius d'aquesta tesi, que ha derivat en 6 publicacions i 4 patents d'invenció, totes elles llicenciades a Devicare, SL , amb sol·licitud de PCT aprovada i esteses a més de 10 països. L'article original 1 descriu l'efecte inhibitori que tenen les mescles binàries dels inhibidors més coneguts de la cristal·lització de l'oxalat càlcic: magnesi, citrat i fitat. L'estudi revela que la mescla de fitat i magnesi produeix un efecte sinèrgic en la inhibició de la cristal·lització de l'oxalat càlcic, mentre que en els altres dos casos (mescles de magnesi i citrat, i de fitat i citrat) l'efecte és purament additiu. L'article original 2 descriu un nou inhibidor de la cristal·lització de l'àcid úric: la teobromina. Aquesta dimetilxantina, present en grans quantitats en el cacau, retarda de manera molt marcada la cristal·lització de l'àcid úric; a més, modifica la morfologia dels cristalls d'àcid úric generats. Atès que les concentracions de teobromina assajades en el treball estan dins dels marges que pot haver-hi en orina, el seu ús podria ser de gran utilitat per als pacients amb litiasi renal úrica. Un cop vist l'efecte de la teobromina en la inhibició de la cristal·lització de l'àcid úric, va ser necessari posar a punt una metodologia analítica per determinar la concentració de teobromina a l’orina. L'article original 3 descriu aquest mètode analític, basat en cromatografia líquida d'alta resolució, acoblat a un sistema de detecció ultraviolat. Una vegada validat aquest mètode es va utilitzar per dur a terme un estudi en 80 infants sans, per tal de demostrar la relació existent entre el consum d'aliments que provenen del cacau, i l'excreció urinària de teobromina. Tot i que aquest mètode és molt senzill i útil, únicament permet analitzar la concentració de teobromina. No obstant això, ens va semblar rellevant poder disposar d'un mètode més ampli, que possibilités analitzar altres metilxantines (com la cafeïna o la teofil·lina), alguns metabòlits d'aquestes substàncies, i altres substàncies com la hipoxantina, la xantina i l'àcid úric, que també estan implicats en la malaltia litiàsica. Així, l'article original 4 descriu un mètode analític per cromatografia líquida d'alta resolució acoblat a un espectròmetre de masses d'alta resolució. Aquest mètode ens permet analitzar dotze compostos en orina en un període de temps de 10 minuts . Un altre dels aspectes en què s'ha pretès avançar durant el desenvolupament d'aquesta tesi és en la millora de les eines diagnòstiques. Especialment, hem centrat els esforços en millorar la mesura del pH urinari, un paràmetre essencial en la malaltia litiàsica, i en el tipus de mostra d'orina utilitzada per realitzar les mesures del risc litogen urinari. En l'article original 5 es comparen dos mètodes de mesura de pH: la tira reactiva, molt utilitzada per malalts litiàsics i en hospitals, i un nou dispositiu patentat pel Laboratori d'Investigació en Litiasi Renal. Tots dos mètodes es comparen amb el mètode de referència: el pH-metre amb elèctrode de vidre. L'estudi mostra que la tira reactiva no té la precisió suficient per a poder ser utilitzada en l'àmbit de la litiasi renal, mentre que el nou dispositiu és precís, senzill, i pot ser utilitzat pel propi pacient a casa seva. Per acabar, en l'article original 6, es van recollir mostres d'orina de 24 hores, que és la mostra utilitzada per al diagnòstic d'alteracions metabòliques urinàries, en 257 infants i adults, tant sans com litiàsics. Aquesta mostra d'orina es va dividir en dues recollides: 12 hores diürna (des de les 8:00 fins a les 20:00) al primer pot, i 12 hores nocturna (des de les 20:00 fins a les 8:00 del dia següent) al segon. Es va estudiar el risc litogen urinari utilitzant diferents fórmules de risc tant en ambdues mostres d'orina per separat, com en el total de les 24 hores. Els resultats demostren que les fórmules de risc donen valors més elevats per als pacients litiàsics que per al grup control, i a més s'observa que l'orina nocturna té els valors de risc litogen més elevats, tant en infants com en adults. D'aquesta manera, l'orina de 12 hores nocturna pot ser una alternativa a l'orina de 24 hores per a l'estudi del risc de cristal·lització en el pacient litiàsic.

[eng] Renal lithiasis is a disease that consists in the formation of stones inside the kidneys or the urinary tract. Metabolic abnormalities in stone-forming patients are diagnosed using a 24-hour urine sample and treatment must be adapted to the type of stone or calculus found in these patients. Treatment using crystallization inhibitors, such as citrate, phytate, or magnesium, offers a good approach and has been demonstrated to be effective. Nevertheless, the diagnosis of urolithiasis presents important drawbacks and reaching further progress in the study of crystallization inhibitors is necessary. The objectives of this thesis address the need to improve our knowledge about crystallization inhibitors and to improve diagnostic tools. The work presented here resulted in 6 publications and 4 patents, all of which are licensed to Devicare, SL, with approved PCT application, and extend to more than 10 countries. Original article 1 describes the inhibitory effect of binary mixtures of the best known calcium oxalate crystallization inhibitors: magnesium, citrate and phytate. The study reveals that the mixture of phytate and magnesium produces a synergistic effect in inhibiting calcium oxalate crystallization, whereas two other mixtures (magnesium and citrate; phytate and citrate) produce additive effects. Original article 2 describes a new uric acid crystallization inhibitor: theobromine. This dimethylxanthine, present in high amounts in cocoa and cocoa products, markedly delays the crystallization of uric acid and modifies the morphology of the resulting uric acid crystals. Since theobromine concentrations tested in this study are within the normal found in urine, the use of this new crystallization inhibitor may be of great utility for uric acid stone-forming patients. Thus, after demonstrating the effect of theobromine on uric acid crystallization, we found necessary to develop a simple analytical methodology to determine the concentration of theobromine in urine. Original article 3 describes such method, based on high performance liquid chromatography coupled to a photodiode array detector. This method was used to demonstrate the relationship between the consumption of cocoa products and the urinary excretion of theobromine in 80 healthy children. While this method is very simple and useful, it only allowed us to analyze the concentration of theobromine. We thought that it would be important to develop a broader method allowing us to analyze other methylxanthines (such as caffeine or theophylline), some metabolites of these substances, and other substances such as hypoxanthine, xanthine and uric acid, which are also involved in renal lithiasic disease. Thus, in original article 4, using an ultra-high performance liquid chromatography system coupled to a highresolution mass spectrometer, we were able to develop such method, capable of analyzing twelve compounds in urine in only 10 minutes. Other aspects that we sought to improve in this thesis are the diagnostic tools used in urolithiasis. In particular, we had two major objectives: to improve the urinary pH measurement (an essential parameter in renal lithiasis), and to improve the type of urine sample used to perform the urinary lithogenic risk measurements. Thus, in original article 5, we compared two methods of pH measurement: the dipstick, widely used by patients with renal lithiasis and hospitals, and a new device patented by the Laboratory of Renal Lithiasis Research. We compared both methods to the pH-meter with glass electrode (widely regarded as the reference method). The study shows that the dipstick is not accurate enough to be used in renal lithiasis. In contrast, the new device is accurate, easy to use, and usable by the patient at home. Finally, in original article 6, 24-hour urine samples, which are the “gold standard” for the diagnosis of urinary metabolic abnormalities, were collected in healthy and stone-forming children and adults. We collected urine samples in two separated flasks: 12 hours day in the first flask (from 8 a.m. to 8 p.m.), and 12 hours night (from 8 p.m. to 8 a.m next morning) in the second one. We studied the urinary lithogenic risk using different risk formulas, for each urine sample as well as across the 24 hours period. The results show that the risk formulas yield greater values for lithiasic patients than for the control group, and that the 12-h overnight urine sample provides the highest lithogenic risk values, both in children and adults. Thus, the overnight urine sample may be a viable alternative to 24-hour urine collection to study of the crystallization risk in stoneforming patients.