Immunological and pharmacological characterisation of imidazoline receptors and neuroprotective effects of imidazoline drugs in the kainic acid-model of excitotoxicity in mice

Abstract

[eng] The present Ph.D. dissertation in Neuropharmacology comprises three studies that aimed 1) to detect, characterise and compare immunoreactive imidazoline receptor (IR) proteins in different preparations, 2) to assess the regulation of apoptotic and neurotoxic signalling in the mouse brain after treatment with the glutamate analogue kainic acid (KA), and 3) to investigate the potential of repeated pretreatment with I1-, I2- and mixed I1-/I2-IR agonists to inhibt KA-induced excitotoxicity in mice. The existence of three IR subtypes (I1-3-IR) is generally accepted, but the molecular nature of such receptors remains to be established to date. In this Ph.D. work, three different IR antibodies were used in various immunological and pharmacological approaches to characterise two subtypes of imidazoline receptors (I1- and I2-IRs) in the mammalian brain and in cells. The reported findings indicate that brain-type I1-IRs constitute a heterogeneous group of proteins, which involve nischarin-related peptides of 167 kDa, 105/115 kDa and 85 kDa, whereas immunoreactive I2-IRs are related to 66 kDa, 45 kDa and 30 kDa proteins. Notably, full-length nischarin or IRAS-M (167 kDa), but apparently no other immunoreactive IR peptide, forms part of higher order complexes and is sensitive to strong reducing conditions. The excitotoxin KA has been shown to induce neuronal death mainly through activation of the intrinsic/mitochondrial pathway, and less is known about the contribution of extrinsic/death receptor-mediated apoptosis to KA-induced cell death. To explore this issue, the effect of a single high dose KA on the main components of the extrinsic apoptotic pathway (Fas ligand, Fas receptor, FADD, caspase-8, FLIP) and associated regulatory proteins was studied in the mouse brain. The results of this study show that KA (45 mg/kg) leads to delayed downregulation (at 72 hours) of the extrinsic apoptotic machinery (Fas ligand and receptor aggregates, FADD, caspase-8) with concomitant increases of anti-apoptotic mediators (p-FADD, FLIPS, p-Akt) in mice, indicating the induction of contraregulatory processes to counteract KA neurotoxicity. Based on previous studies that revealed IR ligand-mediated inhibition of both Ca2+ influx and apoptotic signalling, it was hypothesised that I1-/I2-selective compounds might also be protective in the KA model of excitotoxicity. Thus, using the aforementioned experimental design (monophasic KA-induced insult with neurochemical analyses at 72 hours after administration), the potential of repeated pretreatment with I1- (moxonidine), I2- (BU224) and mixed I1-/I2-IR (LSL61122) agonists to inhibt KA-induced excitotoxic signalling was assessed in the third part of this Ph.D. dissertation. These experiments were complemented by acute treatments and by drug combination studies with putative antagonists for the I1- and I2-IR (efaroxan and idazoxan, respectively), to study the acute effects of these compounds and to prove if the effects are mediated by IRs. The results presented in this Ph.D. work show that I1- and I2-IR-selective agonists (moxonidine, BU224 and LSL61122) inhibit central mediators of excitotoxic signalling (such as JNK, calpain and p25/Cdk5) at basal level and after KA in the mouse brain, while only LSL61122 attenuated the Kainduced behavioural syndrome. Further, I1- and I2-IR agonists regulate the activity and localisation of cdk5 through inhibition of p35 cleavage into neurotoxic p25, and alter PSD-95 expression, which, according to the regulatory role of this important scaffold protein at the postsynaptic density, is likely to affect the strength of glutamatergic synapses. Additionally, the drug combination experiments challenged the suitability of the classical IR antagonists efaroxan (I1) and idazoxan (I2) to antagonise the effects of moxonidine and LSL61122 in the present experimental paradigm (due to agonistic properties of the antagonists). Together, these findings indicate that the observed neuroprotective effects of imidazoline compounds (agonists) involve both IR activation and allosteric regulation of non-IR entities.

[cat] Durant la realització d’aquesta Tesi doctoral en Neurofarmacologia es varen plantejar tres objectius principals, 1) La immunodetecció, caracterització i comparació de proteïnes receptores d’Imidazolines (IRs), 2) L’estudi d’alteracions a les vies de senyalització apoptòtiques i neurotòxiques al cervell de ratolí després de l’administració d’àcid kaínic (KA) un anàleg del glutamat, i 3) la investigació del potencial neuroprotector d’agonistes per als dos subtipus de IR (I1-/I2-IR), que s’expressen al cervell, enfront de l’excitotoxicitat induïda per KA en ratolí. S’han descrit tres subtipus de receptors d’imidazolines (I1-3-IR), però la determinació de les entitats moleculars responsables de la unió d’aquests fàrmacs segueix en discussió. Durant la primera part de la Tesi doctoral es caracteritzaren diverses proteïnes IR mitjançant tres anticossos diferents en preparacions de cervell i sistemes cel•lulars i després de la modulació farmacològica amb agonistes d’IRs. Els resultats d’aquest estudi indiquen que els receptors del subtipus I1 constitueixen un grup heterogeni de proteïnes relacionades amb nischarin/IRAS (amb pesos moleculars de 167 kDa, 105/115 kDa i 85 kDa). En canvi, pèptids de 66 kDa, 45 kDa i 30 kDa es relacionen amb el subtipus I2. L’I1-IR de 167 kDa, considerat com a nischarin o IRAS-M, va formar complexes d’alt pes molecular i es sensible a condicions reductores. Estudis previs mostraren que la mort neuronal induïda per KA es du a terme principalment mitjançant la via coneguda com apoptosi intrínseca o mitocondrial. A la segona part de la Tesi doctoral s’ha investigat la regulació dels principals components de la via apoptòtica extrínseca, també anomenada via activada per receptors de mort, als cervells de ratolins tractats amb KA (45 mg/kg, i.p.). Després de l’activació de la via als 90 min (increment de FasL i d’agregats de Fas), KA (72 hores) va originar una disminució general dels components d’aquesta via (FasL, agregats de Fas, FADD, caspasa-8 activa), i, al mateix temps, augmentaren els nivells de les proteïnes anti-apoptòtiques FLIPS, p-Akt i p-Ser191 FADD, així com el quocient p-FADD/FADD, un índex de neuroplasticitat. Aquests resultats suggereixen la inducció de mecanismes de supervivència compensatoris a la mort neuronal retardada esdevinguda per l’administració de KA. Efectes neuroprotectors de lligands selectius per a IRs, com la inhibició de l’entrada d’ions Ca2+ i de la senyalització apoptòtica, suggereixen que aquests fàrmacs podrien tenir un efecte protector en el model d’excitotoxicitat induïda per KA. Per aquest motiu a la tercera part de la Tesi doctoral, es va estudiar el potencial preventiu de tractaments reiteratius amb els agonistes moxonidina (I1-IR), BU224 (I2-IR) i LSL61122 (mixte I1/I2-IR) com a contraposició a l’efecte neurotòxic induït per KA. També es varen du a terme tractaments aguts i d’interacció amb els antagonistes putatius efaroxan (I1-IR) i idazoxan (I2-IR) com a eina per a l’estudi de l’acció dels agonistes. Només el pretractament amb LSL61122 disminueix els efectes conductuals induïts per KA, mentre els tres agonistes inhibeixen gairebé per complet l’activitat de JNK i calpaïna així com la fragmentació p35/p25 al hipocamp després de KA (resultats semblants als tractaments aguts amb aquests fàrmacs). Efaroxan i idazoxan, que mostraren activitat agonística, no antagonitzaren els efectes de la moxonidina i LSL61122 damunt aquestes dianes del KA. Preparats subcel•lulars d’escorça cerebral mostraren continguts reduïts de la proteïna sinaptosòmica PSD-95 (encarregada de regular l’activació de JNK) així com un increment dels complexes p35/Cdk5 (amb funcions de supervivència), després del tractament amb moxonidina, BU224 i LSL61122. Aquests resultats indiquen el paper neuroprotector dels lligands per als subtipus de IR I1 i I2 (moxonidina i BU224), i especialment del lligand mixte I1/I2-IR LSL61122, en contraposició a la senyalització neurotòxica induïda per KA en ratolí. Això suggereix un potencial terapèutic dels fàrmacs IR en malalties que cursen amb neurodegeneració induïda per glutamat.

[spa] En esta Tesis doctoral en Neurofarmacología se plantearon tres objetivos principales, que incluyeron 1) la inmunodetección, caracterización y comparación de proteínas receptoras de imidazolinas (IRs), 2) el estudio de alteraciones de la señalización apoptótica y neurotóxica en cerebro de ratón tras la administración del análogo de glutamato ácido kaínico (KA), y 3) la investigación del potencial neuroprotector de agonistas para los dos subtipos de IR (I1-/I2-IR), que se expresan en cerebro, frente a la excitotoxicidad inducida por KA en ratón. Tres subtipos de receptores para imidazolinas (I1-3-IR) han sido descritos, pero la determinación de las entidades moleculares responsables para la unión de estos fármacos sigue siendo controvertida. En la primera parte de esta Tesis doctoral se caracterizaron varias proteínas IR usando tres anticuerpos diferentes en preparaciones de cerebro, sistemas celulares y tras modulación farmacológica con agonistas de IRs. Los resultados de este estudio indicaron que los receptores del subtipo I1 constituyen un grupo heterogéneo de proteínas relacionadas con nischarin/IRAS (con pesos moleculares de 167 kDa, 105/115 kDa y 85 kDa). En cambio péptidos de 66 kDa, 45 kDa y 30 kDa se relacionaron con el subtipo I2. El I1-IR de 167 kDa, considerado nischarin o IRAS-M, pero ningún otro IR inmunoreactivo, formó parte de complejos protéicos de alto peso molecular y fue sensible a condiciones reductoras. Estudios previos mostraron que la muerte neuronal inducida por KA está mediada principalmente por apoptosis intrínseca o mitocondrial. La segunda parte de esta Tesis doctoral ha investigado la regulación de los principales componentes de la vía extrinseca o mediada por los llamados receptores de muerte en el cerebro de ratones tratados con KA (45 mg/kg, i.p.). Tras una activación de la vía a los 90 min (Fas ligando y agregados de Fas incrementados), KA (72 horas) originó una disminución general en todos los componentes de la vía (Fas ligando, agregados de Fas, FADD, caspasa-8 activada), y, al mismo tiempo, aumentó los niveles de las proteínas anti-apoptóticas FLIPS, p-Akt y p-Ser191 FADD, así como el cociente p-FADD/FADD, un índice de neuroplasticidad. Estos resultados sugieren la inducción de mecanismos de supervivencia para contrarrestar la muerte neuronal retrasada tras la administración de KA. Los efectos neuroprotectores de ligandos selectivos para IRs, como la inhibición de la entrada de iones Ca2+ y de la señalización apoptótica, sugieren que estos fármacos podrían tener un papel protector en el modelo de excitotoxicidad de KA. Por tanto, como tercera parte de esta Tesis doctoral, se investigó el potencial preventivo de pretratamientos repetidos con los agonistas moxonidina (I1-IR), BU224 (I2-IR) y LSL61122 (mixto I1/I2-IR) frente a la señalización neurotóxica inducida por KA. Se realizaron también tratamientos agudos y de combinación con los supuestos antagonistas efaroxan (I1-IR) e idazoxan (I2-IR) para estudiar los mecanismos de acción de los agonistas. Pretratamiento con LSL61122 atenuó el síndrome conductual inducido por KA, mientras que los tres agonistas inhibieron casi completamente la activación de JNK y calpaina así como la fragmentación p35/p25 en el hipocampo tras KA (resultados similares para tratamientos agudos con estos fármacos). Efaroxan e idazoxan, que mostraron actividad agonística, no antagonizaron los efectos de moxonidina y LSL61122 sobre dichas dianas de KA. Preparaciones subcelulares de la corteza cerebral revelaron contenidos reducidos de la proteína synaptosomal PSD-95 (regula la activación de JNK) y un incremento de complejos p35/Cdk5 (con funciones de supervivéncia) tras el tratamiento con moxonidina, BU224 y LSL61122. Estos resultados indicaron el papel neuroprotector de ligandos para los subtipos I1 e I2 de IR (moxonidina y BU224), y especialmente del ligando mixto I1/I2-IR LSL61122, frente a la señalización neurotóxica inducida por KA en el ratón. Además sugieren un potencial terapeútico de fármacos IR en enfermedades asociadas con neurodegeneración mediada por glutamato.