New metabolic aspects of Leptin: muscle cell activity and biological rhythms

Abstract

[spa] Ampliar el conocimiento actual sobre las bases biológicas y moleculares de la interacción entre nutrientes clave específicos y determinados tipos celulares, como las células musculares, es de gran importancia dado que ayudará a pavimentar el camino hacia el desarrollo de nuevas estrategias para combatir enfermedades crónicas de gran prevalencia, como la obesidad y sus co-morbilidades. Así pues, en la presente tesis doctoral se plantearon dos objetivos generales. A) Estudiar el papel de ácidos grasos libres (FFA) específicos, así como más particularmente el de la hormona Leptina, en la regulación de la capacidad metabólica relacionada con el metabolismo energético, así como en la producción de mioquinas clave, en células musculares. Este estudio tiene sus precedentes en resultados previos del Laboratorio y el grupo de investigación donde se llevó a cabo la tesis. B) Investigar la presencia de ritmos circadianos o biológicos en los niveles de Leptina en leche de mamífero, junto con los de otras hormonas relacionadas con ella (Ghrelina y Adiponectina), que podrían estar relacionados con posibles aplicaciones futuras en leches de fórmula. En conjunto, los objetivos generales propuestos trataban específicamente de arrojar luz en nuevos aspectos metabólicos de la Leptina, de acuerdo con una de las principales líneas de investigación del Laboratorio y sus proyectos de investigación. Tres modelos secuenciales en el tiempo se utilizaron en esta tesis. 1- Un modelo tiempo-dependiente “reverso” in vitro, en el que se trataron células musculares C2C12 con FFA (en concreto, una mezcla fisiológica equimolar de los ácidos grasos oleico y linoleico) solos o en combinación con ejercicio-miméticos. 2- Un modelo tiempodependiente “hacia adelante”, de nuevo utilizando miocitos C2C12, para estudiar los efectos del tratamiento con Leptina (en concentraciones fisiológicas) sobre reguladores clave del metabolismo energético (tanto a nivel de expresión génica como de modificaciones post-traduccionales). 3- Una monitorización secuencial en el tiempo de ratas lactantes (las madres) (in vivo) durante diferentes días del periodo de lactancia, analizando los niveles de Leptina, Ghrelina y Adiponectina, tanto en leche como en sangre materna, junto con parámetros morfométricos. Los resultados del primer modelo se explican y discuten en el Artículo 1 de la presente tesis, los del segundo modelo en los Artículos 2 y 3, mientras que los del tercer modelo en el Artículo 4. De forma resumida, parte de los principales resultados obtenidos demostraron que tanto los ejercicio-miméticos (adrenalina y AICAR) como los FFA tienen importantes efectos induciendo la producción de interleuquina 6 (IL6) en células musculares y que los FFA potencian la inducción de IL6 dependiente de la activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y son, por tanto, importantes candidatos como actores principales en el crosstalk músculo-tejido adiposo. Otros resultados clave muestran que la Leptina induce de forma rápida la expresión de genes importantes en la regulación del metabolismo energético en células musculares, como los que codifican para el co-activador 1α del receptor gamma activado por proliferadores peroxisomales (PGC1α), la IL6, la carnitina palmitoil transferasa 1 (CPT1), la proteína desacoplante 3 (UCP3) y la piruvato deshidrogenasa quinasa 4 (PDK4). Estos resultados concuerdan con la adaptación fisiológica de la partición de nutrientes y su oxidación en el músculo en respuesta a las condiciones del entorno. Además, el efecto temprano del tratamiento con Leptina sobre la inducción de la expresión del PGC1α debe destacarse y se sugirió que el mecanismo responsable iría más allá del efecto previamente descrito en la literatura de la Leptina como activadora de la AMPK. Ahondando en la regulación del PGC1α por Leptina en células musculares, se describió también que la Leptina probablemente juega un rol crucial en dichas células modulando las modificaciones post-traduccionales del xx PGC1α con la finalidad de adaptar la respuesta celular al entorno nutricional. Además, se descubrió que la Leptina es capaz de provocar un incremento de la expresión de la Mitofusina 2, una proteína importante en la función mitocondrial y su dinámica. En la última parte de la tesis, y ahondando aún más en el conocimiento sobre las funciones fisiológicas de la Leptina, se describió una fluctuación biológica, que encaja con un patrón circasemidiano, de los niveles de esta hormona en leche de rata durante la lactancia temprana, así como se describió también para las hormonas Ghrelina y Adiponectina. Cabe destacar también, de manera importante, que se descubrió la existencia de un ”milk Leptin surge” (un aumento transitorio y significativo de los niveles de Leptina en leche) alrededor de la mitad del periodo de lactancia, sugiriéndose que podría estar relacionado con el conocido “Leptin surge” descrito anteriormente en sangre de crías y con el desarrollo de la progenie. En resumen, los experimentos llevados a cabo y los resultados obtenidos en la presente tesis permiten describir nuevos aspectos de la Leptina en la regulación metabólica así como de otros nutrientes/moléculas señal, los FFA, en particular respecto a su función en las células musculares y los posibles papeles biológicos de la Leptina durante la lactancia.

[eng] Understanding the molecular biological basis of the interaction between specific key nutrients and cells, such as muscle cells, is important since it would help pave the way for the development of new strategies to combat chronic and prevalent diseases, such as obesity and its associated metabolic disorders. Accordingly, in the present thesis two general objectives were considered: a) to study the role of specific free fatty acids (FFA) and Leptin in the regulation of energy metabolism capacity and the production of key myokines in muscle cells. This study was proposed considering previous results of the Laboratory where the thesis was performed; b) to investigate the presence of daily or biological rhythms of Leptin in mammalian milk, together with other related hormones (Ghrelin and Adiponectin), which may have potential future applications in formula milks. Altogether, the general objectives aimed to shed light onto new metabolic aspects of Leptin, in agreement with one of the main research lines of the Laboratory. Three time-sequential experimental models were used in this thesis: 1) a timereverse in vitro model of C2C12 muscle cells treated with FFA (an equimolar physiological mixture of oleic and linoleic acids) alone or in combination with exercise mimetics; 2) a time-forward in vitro model, again using C2C12 myocytes, to study the effects of Leptin treatment (at physiological concentrations) on key metabolic regulators of energy metabolism (both at the gene expression and post-translational modification levels); and 3) a time-sequential monitoring of pregnant rats (in vivo) at different days of lactation, analysing Leptin, Ghrelin and Adiponectin levels in milk and blood, together with morphometric parameters. The results of the first model are explained and discussed in Article 1, the results of the second model in Articles 2 and 3 and the results of the third model in Article 4. Briefly, part of the main results obtained showed that both exercise mimetics (adrenaline and AICAR) and FFA have profound effects inducing interleukin 6 (IL6) production in muscle cells, and that FFA potentiate the adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) dependent induction of IL6 and are important factors in the muscleadipose tissue crosstalk. Furthermore, other significant results show that Leptin rapidly regulates the expression of key genes in the regulation of energy metabolism in muscle cells, such as those coding for peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 α (PGC1α), Il6, carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1), uncoupling protein 3 (UCP3) and pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4). These results are in line with the physiological adaptation to environmental conditions of nutrient partition and oxidation in muscle. Moreover, the early effect of Leptin treatment regarding PGC1α upregulation was outstanding and the mechanism involved was suggested to go beyond its previously known effect of AMPK activation. It was also described that Leptin probably plays a crucial role in muscle cells by modulating the post-translational modifications of PGC1α in order to adapt the cell to the nutritional environment, and that it is able to upregulate the expression of Mitofusin 2, important in mitochondrial function and dynamics. In the last part of the thesis, which further explores the physiological functions of Leptin, a biological fluctuation of its levels was described in rat milk during the early phase of lactation, which was also found for Ghrelin and Adiponectin, fitting with a circasemidian pattern. Importantly, a “milk Leptin surge” was discovered around midlactation and it is suggested that it may be related with the known Leptin surge in pups and with progeny development. In summary, the experiments performed and results obtained in the present thesis describe new aspects of Leptin in metabolic regulation, as well as of other important xviii signalling molecules/nutrients such as FFA, especially regarding the function of muscle cells and the possible roles of Leptin during lactation.

[cat] Engrandir el coneixement actual sobre les bases biològiques i moleculars de la interacció entre nutrients clau específics i determinats tipus cel·lulars, com ara les cèl·lules musculars, és molt important donat que ajudaria a pavimentar el camí cap al desenvolupament de noves estratègies per combatre malalties cròniques de gran prevalença, com la obesitat i les seves comorbiditats. Així doncs, a la present tesi doctoral es varen plantejar dos objectius generals. A) Estudiar el paper d’àcids grassos lliures (FFA) específics, així com més particularment el de l’hormona Leptina, a la regulació de la capacitat metabòlica relacionada amb el metabolisme energètic, així com la producció de mioquines clau, en cèl·lules musculars. Aquest estudi té els seus precedents en resultats previs del laboratori i del grup de recerca on es va dur a terme la tesi. B) Investigar la presència de ritmes circadiaris o biològics en els nivells de Leptina en llet de mamífer, juntament amb els d’altres hormones relacionades amb ella (Ghrelina i Adiponectina), que podrien estar relacionats amb possibles aplicacions futures en llets de fórmula. En conjunt, els objectius generals proposats tractaven específicament de donar llum a nous aspectes metabòlics de la Leptina, d’acord amb una de les línies principals de recerca del laboratori i dels seus projectes d’investigació. Tres models seqüencials en el temps es van utilitzar en aquesta tesi. 1- Un model temps-depenent “revers” in vitro, en el que es tractaren cèl·lules musculars C2C12 amb FFA (en concret, una mescla fisiològica equimolar dels àcids grassos oleic i linoleic) tot sols o en combinació amb exercici-mimètics. 2- Un model temps-depenent “cap endavant”, novament utilitzant miòcits C2C12, per a estudiar els efectes del tractament amb Leptina (en concentracions fisiològiques) sobre reguladors clau del metabolisme energètic (tant a nivell d’expressió gènica com de modificacions post-traduccionals). 3- Una monitorització seqüencial en el temps de rates lactants (les mares) (in vivo) durant diferents dies del període de lactància, analitzant els nivells de Leptina, Ghrelina i Adiponectina, tant a llet com a sang materna, juntament amb paràmetres morfomètrics. Els resultats del primer model s’expliquen i discuteixen a l’Article 1 de la present tesi, els del segon model als Articles 2 i 3, mentre que els del tercer model a l’Article 4. De forma resumida, part dels principals resultats obtinguts van demostrar que tant els exercici-mimètics (adrenalina i AICAR) com els FFA mostren importants efectes induint la producció de la interleuquina 6 (IL6) en cèl·lules musculars i que els FFA potencien la inducció de IL6 depenent de l’activació de la proteïna quinasa activada per AMP (AMPK) i són, per tant, importants candidats com actors principals al crosstalk múscul-teixit adipós. Altres resultats clau mostren que la Leptina indueix de forma ràpida l’expressió de gens importants en la regulació del metabolisme energètic en cèl·lules musculars, com ara els que codifiquen per al co-activador 1α del receptor gamma activat per proliferadors peroxisomals (PGC1α), la IL6, la carnitina palmitoil transferasa 1 (CPT1), la proteïna desacoblant 3 (UCP3) i la piruvat deshidrogenasa quinasa 4 (PDK4). Aquests resultats concorden amb l’adaptació fisiològica de la partició de nutrients i la seva oxidació en el múscul en resposta a l’entorn. A més a més, l’efecte primerenc del tractament amb Leptina sobre la inducció de l’expressió del PGC1α ha de ser destacada i es va suggerir que el mecanisme responsable aniria més enllà de l’efecte prèviament descrit a la literatura de la Leptina com activadora de l’AMPK. Aprofundint en la regulació del PGC1α per Leptina a cèl·lules musculars, es va descriure també que la Leptina probablement juga un rol crucial en dites cèl·lules modulant les modificacions posttraduccionals del PGC1α amb la finalitat d’adaptar la resposta cel·lular a l’entorn nutricional. A més a més, es va descobrir que la Leptina és capaç de provocar un xxii increment de l’expressió de la Mitofusina 2, una proteïna important per a la funció mitocondrial i la seva dinàmica. En la darrera part de la tesis, i profunditzant encara més en el coneixement damunt les funcions fisiològiques de la Leptina, es va descriure una fluctuació biològica, que encaixa amb un patró circasemidiari, dels nivells d’aquesta hormona en llet de rata durant la lactància primerenca, així com es va descriure també per a les hormones Ghrelina i Adiponectina. Cal destacar també, de forma molt important, que es va descobrir l’existència d’un “milk Leptin surge” (un augment transitori i significatiu dels nivells de Leptina a la llet) envoltant la meitat del període de lactància, suggerint que podria estar relacionar amb el conegut “Leptin surge” descrit anteriorment a sang de cries i amb el desenvolupament de la progènie. En resum, els experiments duts a terme i els resultats obtinguts a la present tesi permeten descriure nous aspectes de la Leptina en la regulació metabòlica així com d’altres nutrients/molècules senyal, com ara els FFA, en particular respecte a la seva funció en les cèl·lules musculars i els possibles papers biològics de la Leptina durant la lactància.