Identificación de genes candidatos en enfermedades complejas mediante análisis genético y estudios funcionales de sus mecanismos de patogenicidad. Caracterización de la estructura y función de la proteína DISC1 (Disrupted in Schizophrenia 1) en la mitocondria

Abstract

[spa] Las enfermedades complejas se caracterizan por presentar herencia poligénica e influencia del ambiente. Las técnicas genómicas de última generación permiten identificar nuevos genes candidatos que contribuyen a la etiología de dichas enfermedades. En esta tesis hemos centrado nuestros análisis en dos enfermedades complejas causadas por defectos en el desarrollo: las cardiopatías congénitas (CC) y las enfermedades mentales graves (EMG). La técnica de SNP-Array ha permitido determinar variaciones en el número de copia (CNVs) en una cohorte de pacientes con CC de causa desconocida y sin antecedentes familiares. Además, se ha realizado un análisis de ligamiento en los casos familiares. Con los genes contenidos en las deleciones y duplicaciones encontradas, se han realizado análisis de priorización, de vías metabólicas y una comparativa bibliográfica, que han permitido identificar los genes IGF1R, PRKCE y THBS2, como candidatos a participar en la fisiopatología de las CC. En cuanto al análisis de ligamiento se han identificado 2 regiones que segregan con la enfermedad, 18q21.2-18q21.3 y 15q26.3. En la región del cromosoma 18 se localiza el gen TCF4 y en la región del cromosoma 15 los genes SELS, SNRPA1 y PCSK6, potenciales candidatos a causar CC. La tecnología de secuenciación del exoma humano (WES), se ha aplicado para identificar mutaciones que segreguen con EMG en dos familias con elevada prevalencia. Tres variantes poco frecuentes contenidas en los genes TRIP12, RNF25 y ARHGAP19, segregan con EMG. Criterios funcionales, de conservación del residuo mutado y de predicción proteica apoyan su potencial patogenicidad. Estudios funcionales serán necesarios para confirmar su implicación en la fisiopatología de las EMG. Con dicha finalidad, se ha estudiado el gen Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1), identificado en un amplio linaje escocés segregando con EMG. Los miembros afectos eran portadores de una translocación balanceada (1, 11)(q42.1;q14.3) que genera una forma truncada de la proteína DISC1. DISC1 es de expresión ubicua, aunque está enriquecida en la mitocondria. Nuestro objetivo era identificar su topología y función mitocondrial. Mediante estudios de subcompartimentación mitocondrial, basados en aislamiento de mitoplastos y protección de digestión proteica, identificamos DISC1 en el espacio intermembrana, anclada a la membrana mitocondrial interna. Dicha sublocalización sugería que DISC1 podía formar parte de algún complejo proteico. Estudios de ensamblaje por BN-PAGE seguidos de 2D-WB, identificaron DISC1 en el complejo MICOS (Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System), responsable del mantenimiento de las crestas mitocondriales. Para descifrar la función de DISC1 en MICOS, se generó una línea celular estable deficitaria de DISC1 (SH-SY5Y-DISC1 KD), mediante infección lentiviral con shRNA contra DISC1 humano. El déficit de DISC1 provocó desensamblaje parcial del complejo MICOS, afectando a la expresión de sus subunidades. También afectó al ensamblaje del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS). Como consecuencia de esta alteración estructural, las células DISC1 KD evidenciaron un marcado déficit bioenergético: dificultad de crecimiento en medio suplementado con galactosa, disminución en la síntesis de ATP, consumo de oxígeno y potencial de membrana. Curiosamente, dicha carencia bioenergética fue parcialmente revertida al sobreexpresar DISC1 recombinante salvaje en las células DISC1 KD, pero no al sobreexpresar la forma truncada identificada en la familia escocesa. Finalmente, se observó que el déficit bioenergético de las células DISC1 KD afectaba a su capacidad de diferenciación, proyectaban menos neuritas al cultivarlas en medio suplementado con ácido retinoico y factor de crecimiento neuronal. Esta tesis ha permitido identificar nuevos genes candidatos asociados a CC y EMG, que pueden contribuir a conocer nuevas vías implicadas en la fisiopatología de dichas enfermedades, ayudando a su predicción y mejorando los tratamientos. Por otro lado, los conocimientos aportados sobre la proteína DISC1 han permitido identificar nuevas dianas susceptibles de intervención terapéutica.

[cat] Les malalties complexes es caracteritzen per presentar una herència poligènica i influència de l’ambient. Les tècniques genòmiques de darrera generació permeten identificar nous gens candidats que contribueixen a l’etiologia d’aquestes malalties. En aquesta tesi hem centrat els nostres anàlisi en dues malalties complexes causades per defectes en el desenvolupament, les cardiopaties congènites (CC) i les malalties mentals greus (MMG). La tècnica de SNP-Array ha permès determinar variacions en el nombre de còpies (CNVs) en una cohort de pacients amb CC de causa desconeguda i sense antecedents familiars. A més, s’ha dut a terme un anàlisi de lligament en els casos familiars. Amb els gens continguts en les delecions i duplicacions trobades s’han realitzat anàlisis de priorització, de vies metabòliques i una comparativa bibliogràfica, que ha permès identificar els gens IGF1R, PRKCE i THBS2 com a candidats a participar en la fisiopatologia de les CC. En referència a l’anàlisi de lligament s’han identificat 2 regions que segreguen amb la malaltia, 18q21.2-18q21.3 i 15q26.3. En la regió del cromosoma 18 es localitza el gen TCF4 i en la regió del cromosoma 15 els gens SELS, SNRPA1 i PCSK6, potencials candidats a causar CC. La tecnologia de seqüenciació de l’exoma humà (WES) s’ha aplicat per identificar mutacions que segreguen amb MMG en dues famílies amb elevada prevalença. Tres variants rares contingudes en els gens TRIP12, RNF25 i ARHGAP19 segreguen amb MMG. Criteris funcionals, de conservació de residu mutat i de predicció proteica recolzen la seva potencial patogenicitat. Seran necessaris estudis funcionals per confirmar la seva implicació en la fisiopatologia de les MMG. Amb aquesta finalitat, s’ha estudiat el gen Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1), identificat en un ampli llinatge escocès segregant amb MMG. Els membres afectes eren portadors d’una translocació balancejada (1, 11)(q42.1;q14.3) que genera una forma truncada de la proteïna DISC1. DISC1 és d’expressió ubiqua encara que es troba enriquida a la mitocòndria. El nostre objectiu era identificar la seva topologia i funció mitocondrial. Mitjançant estudis de subcompartimentació mitocondrial basats en l’aïllament de mitoplastes i protecció de digestió proteica, vàrem identificar DISC1 a l’espai intermembrana, ancorada a la membrana mitocondrial interna. Aquesta sublocalització suggeria que DISC1 podia formar part d’algun complex proteic. Estudis d’acoblament mitjançant BN-PAGE seguits de 2D-WB, identificaren DISC1 en el complexe MICOS (Mitochondrial Contact Site and cristae Organizing System), responsable del manteniment de les crestes mitocondrials. Per desxifrar la funció de DISC1 a MICOS es va generar una línia cel•lular estable deficitària de DISC1 (SH-SY5Y-DISC1 KD), mitjançant infecció lentiviral amb shRNA contra DISC1 humà. El dèficit de DISC1 provocà el desacoblament parcial del complexe MICOS, afectant a l’expressió de les seves subunitats. També afectà a l’acoblament del sistema de fosforilació oxidativa (OXPHOS). Com a conseqüència d’aquesta alteració estructural, les cèl•lules DISC KD evidenciaren un marcat dèficit bioenergètic: dificultat de creixement en medi suplementat amb galactosa, disminució en la síntesis d’ATP, consum d’oxigen i potencial de membrana. Curiosament, aquesta carència bioenergètica fou parcialment revertida al sobreexpressar DISC1 recombinant salvatge en les cèl•lules DISC1 KD, però no al sobreexpressar la forma truncada identificada en la família escocesa. Finalment, es va observar que el dèficit bioenergètic de les cèl•lules DISC1 KD afectava a la seva capacitat de diferenciació, projectaven menys neurites cultivant-les en medi suplementat amb àcid retinoic i factor de creixement neuronal. Aqueta tesi ha permès identificar nous gens candidats associats a CC i MMG, que poden contribuir a conèixer noves vies implicades en la fisiopatologia d’aquestes malalties ajudant a la seva predicció i millorant els tractaments. D’altra banda, els coneixements aportats sobre la proteïna DISC1 han permès identificar noves dianes susceptibles d’intervenció terapèutica.

[eng] Complex diseases are characterized by polygenic inheritance and environmental factors. Next generation techniques have allowed the identification of new candidate genes involved in the etiology of these diseases. This thesis focused in two development-related complex diseases: congenital heart diseases (CHD) and major mental disorders (MMD). Copy number variations (CVNs) were identified by SNP-Array in a patient cohort with CHD of unknown cause and no family background. Moreover, a linkage analysis was performed in family members. Genes contained in deletions and duplications were analyzed through prioritization analysis, pathway analysis and a literature comparison. These approaches identified genes IGF1R, PRKCE and THBS2 as candidate genes to participate in CHD physiopathology. Linkage analysis identified two linkage regions with CHD: 18q21.2-18q21.3 and 15q26.3. TCF4 is a gene localized within chromosome 18, and genes SELS, SNRPA1 and PCSK6 in chromosome 15. Whole exome sequencing (WES) was used to identify rare variants linked to MMD in two families with high prevalence. All three variants affect highly conserved residues and the supposed protein function with the predicted protein secundary change induced by the mutation support their pathogenicity, that will have to be validated by functional analysis. For the same pourpose we studied the role of Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) in the mitochondria. DISC1 is a susceptibility gene associated to MMD, identified in a large Scottish family with high prevalence of schizophrenia, bipolar disorder and major depression. A balanced translocation t(1,11)(q42.1;q14.3) segregated with affected family members that disrupted DISC1, generating a protein truncated form. DISC1 is ubiquitous but is enriched in mitochondria. Our goal was to identify DISC1 topology and function. Through mitochondrial subfractionation, based on mitoplasts isolation and proteinase K digestion, DISC1 was identified associated to inner mitochondrial membrane facing to the intermembrane space. This sublocalization suggests its implication in a multiprotein complex. DISC1 was identified in MICOS complex (Mitochondrial Contact Site and cristae Organizing System) through BN-PAGE followed by 2D-WB. MICOS is responsible of mitochondrial cristae maintenance. To learn about DISC1 function, a stable cell line with depleted DISC1 was generated (SH-SY5Y-DISC1 KD) with shRNA lentiviral infection against human DISC1. DISC1 depletion caused partial disassembly of MICOS complex and affected MICOS subunits expression. It also affected oxidative phosphorylation (OXPHOS) assembly complexes. As a consequence of this structural deficiency, DISC1 KD cells showed high bioenergetics deficiency. DISC1 KD cells had growth problems in galactose media and also reduced ATP synthesis, diminished oxygen consumption rate and membrane potential. Interestingly, these bioenergetic defects partially reverted by overexpressing recombinant DISC1 full length in SH-SH5Y DISC1 KD cells, but not by overexpression of the DISC1 truncated form identified in the Scottish family. Furthermore, as a consequence of the bioenergetic failure, DISC1 SH-SY5Y KD cells also evidenced impaired capacity to differenciate into neurons. DISC1 KD cells projected less neurites once cultured in the presence of retinoic acid and brain derived neurotrophic factor. This thesis has allowed the identification of new candidate genes associated to CHD and MMD. Our newly candidate genes can contribute to elucidate novel pathways involved in the physiopathology of these diseases, contributing to its prevention and treatments. By the other hand, knowing DISC1 mitochondrial structure and function may contribute to develope novel strategies of therapeutical intervention.