Micobacterias ambientales asociadas a sistemas de distribución de aguas potables y puras

Abstract

[spa] Las micobacterias ambientales, conocidas también como micobacterias atípicas o micobacterias no tuberculosas, son microorganismos saprófitos, frecuentes en suelo, alimentos, polvo y especialmente, agua. Son oligotróficas, capaces de crecer en concentraciones bajas de materia orgánica y en un amplio rango de temperaturas, con variaciones de pH e incluso a bajas concentraciones de oxígeno, siendo resistentes a los desinfectantes, metales pesados y antibióticos. Pueden ser patógenos oportunistas de humanos y animales aunque, en general, son habitantes normales del medio ambiente. Son capaces de colonizar y crecer en las conducciones de agua en hospitales, edificios de apartamentos y casas, formando biopelículas, que pueden convertirse en una posible fuente de infección, al transmitirse a través de las aguas, aerosoles o polvo y ser inhaladas o ingeridas. Es por ello que su estudio es de interés en salud pública, adquiriendo una especial relevancia en los ambientes hospitalarios. En los últimos años ha ido aumentando el interés por el potencial patogénico de las micobacterias, y también se ha puesto de manifiesto el papel ecológico que pueden jugar estos patógenos oportunistas presentes en las conducciones de agua. En un estudio pionero previo, llevado a cabo por el grupo de investigación de Microbiología de la Universidad de las Islas Baleares y de la unidad de diálisis del Hospital Son Llàtzer en Palma de Mallorca, se analizó la comunidad microbiana presente en aguas puras de hemodiálisis, por métodos dependientes e independientes de cultivo, y se detectó un inesperado porcentaje de aislados de micobacterias ambientales, una de las cuales dio origen a la descripción de una nueva especie, denominada M. llatzerense, posteriormente identificado como patógeno en muestras clínicas. La presente tesis doctoral plantea como objetivo principal detectar y caracterizar micobacterias ambientales presentes en muestras de aguas potables y puras, por métodos dependientes e independientes de cultivo. La detección de micobacterias por métodos independientes de cultivo, en las aguas puras de hemodiálisis, se ha basado en el análisis de genotecas del gen rDNA 16S y por RT-PCR del mismo gen utilizando cebadores universales, así como empleando cebadores específicos de micobacterias. En las dos primeras genotecas no se detectaron clones afiliados al género Mycobacterium. Éstos sí se revelaron al usar cebadores específicos en una PCR-anidada. En cuanto a los métodos dependientes de cultivo, se utilizaron distintas estrategias para la detección de micobacterias ambientales, evaluándose su eficacia. El análisis multigénico de los aislados obtenidos reveló que los aislados de origen ambiental se clasificaban exclusivamente en el grupo de micobacterias de crecimiento rápido, mientras que las de origen clínico pueden ser de crecimiento rápido o lento. Se han aislado e identificado especies potencialmente patógenas, principalmente micobacterias de crecimiento rápido, tanto por métodos dependientes como independientes de cultivo, que en el caso de muestras hospitalarias pueden suponer un riesgo de infección para pacientes inmunocomprometidos. Este estudio hace especial hincapié en la necesidad de mejorar el control de los procesos de desinfección efectivos en estos tipos de aguas, monitorizar continuamente el suministro de agua y adoptar en el caso de muestras ambientales hospitalarias, medidas profilácticas eficientes para minimizar la exposición de pacientes inmunodeprimidos a fuentes contaminadas.

[cat] Els micobacteris ambientals, coneguts també com a micobacteris atípics o micobacteris no tuberculosos, són microorganismes sapròfits, freqüents a sòl, aliments, pols i especialment, aigua. Són oligotròfics, capaços de créixer a concentracions baixes de matèria orgànica i a un ampli rang de temperatures, amb variacions de pH i, fins i tot, a baixes concentracions d'oxigen. Són resistents als desinfectants, metalls pesants i antibiòtics. Poden ser patògens oportunistes d'humans i animals encara que, en general, són habitants normals del medi ambient. Són capaços de colonitzar i créixer a les conduccions d'aigua en hospitals, edificis d'apartaments i cases, formant biopel·lícules, que poden convertir-se en una possible font d'infecció, quan es transmeten a través de les aigües, aerosols o pols, i ser inhalades o ingerides. És per això, que el seu estudi és d'interès en salut pública, adquirint una especial rellevància en els ambients hospitalaris. En els darrers anys ha anat augmentant l'interès pel potencial patogènic dels micobacteris, i també s'ha posat de manifest el paper ecològic que poden jugar aquests patògens oportunistes presents a les conduccions d'aigua. En un estudi pioner previ, dut a terme pel grup de recerca de Microbiologia de la Universitat de les Illes Balears i de la unitat de diàlisi de l'Hospital Son Llàtzer a Palma de Mallorca, es va analitzar la comunitat microbiana present a les aigües pures de hemodiàlisi, per mètodes dependents i independents de cultiu, i es va detectar un inesperat percentatge d'aïllats de micobacteris ambientals, un dels quals va donar origen a la descripció d'una nova espècie, anomenada M. llatzerense, posteriorment identificada com a patògen en mostres clíniques. L’objectiu principal de la present tesi doctoral és detectar i caracteritzar els micobacteris ambientals presents a mostres d'aigües potables i pures, per mètodes dependents i independents de cultiu. La detecció de micobacteris per mètodes independents de cultiu, a les aigües pures d'hemodiàlisi, s'ha basat en l'anàlisi de genoteques del gen rDNA 16S i per RT-PCR del mateix gen utilitzant encebadors universals, així com emprant encebadors específics de micobacteris. En les dues primeres genoteques no es van detectar clons afiliats al gènere Mycobacterium. Aquests sí que es van detectar quan s’empraren encebadors específics en una PCR-imbricada. Pel que fa als mètodes dependents de cultiu, es van utilitzar diferents estratègies per a la detecció de micobacteris ambientals, avaluant la seva eficàcia. L'anàlisi multigènica dels aïllats obtinguts va mostrar que els aïllats d'origen ambiental es classificaven exclusivament en el grup de micobacteris de creixement ràpid, mentre que les d'origen clínic poden ser de creixement ràpid o lent. S’han aïllat i identificat espècies potencialment patògenes, principalment micobacteris de creixement ràpid, tant per mètodes dependents com independents de cultiu, que en el cas de mostres hospitalàries poden suposar un risc d'infecció per a pacients immunocompromesos. Aquest estudi fa especial èmfasi en la necessitat de millorar el control dels processos de desinfecció efectius en aquests tipus d'aigües, monitoritzar contínuament el subministrament d'aigua i adoptar en el cas de mostres ambientals hospitalàries, mesures profilàctiques eficients per minimitzar l'exposició de pacients immunodeprimits a fonts contaminades.

[eng] Environmental mycobacteria, also known as atypical mycobacteria or nontuberculous mycobacteria, are saprophytic microorganisms, frequent in soil, food, dust and especially water. They are oligotrophic, able to grow at low concentrations of organic matter and in a wide range of temperatures, pH, and even at low oxygen concentrations. Mycobacteria are resistant to disinfectants, antibiotics and heavy metals. They can be opportunistic pathogens of humans and animals but, in general, are considered environmental bacteria. They are able to colonize and grow in hospital water lines, apartment buildings and houses, forming biofilms, which can become a potential source of infection, transmitted through water, aerosols or dust and consequently be inhaled or ingested. For this reason their study is of interest in public health, acquiring special relevance in hospital environments. The interest in the study of potential pathogenic mycobacteria has been increasing in the last years, and their ecological role in the water pipes has been also highlighted. In a previous pioneering study, conducted by the research group of Microbiology at the University of the Balearic Islands and the dialysis unit of the Hospital Son Llàtzer in Palma de Mallorca, the microbial community present in hemodialysis pure water was analyzed using culture dependent and independent methods. An unexpected high percentage of environmental mycobacteria were detected, one of which led to the description of a new species, M. llatzerense, later identified as an opportunistic pathogen in clinical samples. The main objective of this doctoral thesis is the detection and characterization of environmental mycobacteria present in drinking water and pure water by using culture dependent and independent methods. The detection of mycobacteria by culture independent methods, in hemodialysis pure water has been based on the analysis of 16S rRNA gene libraries and by RT-PCR from the same gene product using universal primers, and also specific primers for mycobacteria. No clones were assigned to the genus Mycobacterium in the first two 16S rDNA gene libraries. They were detected by using specific primers in a nested-PCR. In the culture dependent methods, different strategies for the detection of environmental mycobacteria were used, and their effectiveness was assessed. The multilocus sequence analysis of the isolates obtained revealed that isolates from environmental sources were classified only in the group of rapidly growing mycobacteria, while isolates of clinical origin could be classified as fast or slow growing mycobacteria. Potentially pathogenic species have been isolated and identified, mainly rapidly growing mycobacteria, using both culture dependent and independent methods. In the case of hospital samples they may represent a risk for immunocompromised patients. This study strongly emphasizes the need to improve control of effective disinfection procedures in these types of waters, continuously monitor the water, and implement efficient prophylactic measures in the case of hospital environmental samples to minimize the exposure of immune compromised patients to the contaminated sources.