Characterization of the anti-tumor activity of plants extracts from North Africa: Morocco

Abstract

[spa] El valor medicinal de las plantas es conocido desde siglos, este ha permitido el desarrollo de un gran número de fármacos antitumorales de alta eficacia. En Marruecos, las plantas son importantes para la medicina tradicional, ya que son consideradas una potencial fuente de moléculas bioactivas. El trabajo presentado en esta tesis coincide con la estrategia nacional de promover las plantas medicinales de Marruecos, desarrollando así el conocimiento ancestral y especifico de las distintas especies de plantas. Cuatro plantas medicinales fueron seleccionadas, en base a un estudio etnobotánica y de acuerdo con sus usos tradicional en medicina. Diez y seis extractos de plantas fueron ensayadas en un panel de líneas celulares humanas, incluyendo líneas celulares de tumores sólidos y hematológicos, así como fibroblastos no transformados. Los ensayos de viabilidad revelaron que al menos uno de los extractos de planta mostró actividad citotóxica en la mayoría de las líneas celulares testadas, siendo los valores de IC50 para la mayoría de los extractos cercanos a 30 ug/mL. Posteriormente, nos enfocamos en los efectos anti apoptóticos y anti-leucemia de Rm- HE, el cual mostro un efecto marcado en las células Jurkat promoviendo el arresto de ciclo celular y un apoptosis dependiente de JNK, lo cual fue evidenciado por el aumento de los niveles de Fas-L y la activación de las caspases 8,3,7 y 9. También se llevo a cabo un estudio detallado del mecanismo de acción de Mv-DF, determinándose la distribución del ciclo celular y la inducción de apoptosis mediante citometría de flujo para las líneas celulares Jurkat y Jeko-1. Después de 48h de tratamiento se detectó un aumento de la caspases 3 y 7, una disminución de la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y la inactivación de PARP. En relación a Ormenis Erioplepis, la medición de la viabilidad celular nos permitió calcular los valores de IC50 para los extractos más prometedores, específicamente Oe-DF y Oe-HE. El análisis de citometría de flujo junto con la monitorización de los niveles de p- H2A.X mostró que tanto las fracciones de diclorometano como las de hexano indujeron quiebres dobles en el ADN (doble strands brakes) junto con arresto en G1 (Jurkat, Jeko-1 and LN229), y G2/M (PC-3) lo que concuerda con datos obtenidos para la actividad de las caspasas. Además se llevo a cabo un estudio de la composición química y de los compuestos bioactivos mediante GC-MS para Rm-HE, Mv-DF Oe-DF y Oe-HE. Finalmente los datos obtenidos en este estudio deberían honrar al conocimiento ancestral y proporcionar un soporte científico al uso de estas plantas por herbolarios y curadores tradicionales, además de promover futuros estudios.

[fra] L’exploitation des pharmacopées traditionnelles, notamment l’utilisation des plantes connues souvent depuis des siècles pour leur valeur médicinale; a permis depuis toujours, la mise en place d'un très grand nombre de médicaments anticancéreux, d'une très grande efficacité. Au Maroc, les plantes occupent un rôle très important dans la médecine traditionnelle qui constitue l’une des sources importantes pour le criblage de nouvelles molécules potentiellement bioactives à visée thérapeutique. Le travail présenté dans cette thèse s’inscrit dans le cadre de la stratégie nationale visant à valoriser les plantes médicinales marocaines, et cela, par le développement du savoir ancestrale et les connaissances spécifiques des espèces végétales. Ainsi, Quatre plantes médicinales ont été sélectionnées, sur la base d’une étude ethnobotanique et en fonction de leurs utilisations en médecine traditionnelle, et ensuite, évaluées pour leurs effets cytotoxiques vis-à-vis d’un large panel de lignées cellulaires cancéreuses de différentes origines. Les résultats de viabilité cellulaire ont révélé qu’au moins un des extraits de chacune des plantes : Inula viscosa, ormenis eriolepis (asteracées), Retama monosperma (fabacées) et Marrubium vulgare (lamiacées) a été en mesure d’exercer une forte activité cytotoxique contre la majorité des lignées cellulaires testées. Les valeurs d’IC50 enregistrées ont été dans la plupart des cas ≤30μg/ml. Par la suite, nous montrons l’effet anti-leucémique spécifique que présente l’extrait hexanique de Rétama monosperma sur la lignée cellulaire « Jurkat ». Rm-HE a montré une cytotoxicité significative contre ces cellules, alors qu'il s’est avéré essentiellement inefficace contre les fibroblastes normaux de souris (NIH3T3) et les lymphocytes normaux (TK-6). L’apoptose induite par ce dernier, était partiellement dépendante de JNK et caractérisée par une surexpression du Fas-L ainsi qu’une activation des caspases 8, 3, 7 et 9. Une étude détaillée du mécanisme d’action de Mv-DF a également été réalisée, ses effets sur la distribution du cycle cellulaire et l’induction de l’apoptose ont été mis évidence par une analyse cytométrique montrant des arrêts en G1 pour les deux lignées (Jurkat et Jeko- 1), accompagnés par une forte augmentation de l’activité des caspases effectrices 3 et 7, une inhibition des protéines anti-apoptotique (Bcl-2 et Mcl-1), ainsi qu’une inactivation du PARP, après 48h du traitement. Concernant Ormenis erioplepis, les mesures de viabilité cellulaires, nous ont permis de calculer les valeurs d’IC50 pour les extraits les plus prometteurs, notamment, Oe-DF et Oe- HE sur les lignées les plus sensibles. L’analyse de la distribution du cycle cellulaire et le taux d’expression de la pH2A.X a montré qu’ils induisaient une cassure des doubles brins d’ADN accompagnée par un arrêt du cycle en phase G1 chez les cellules : Jurkat, Jeko-1 et LN229, et en G2/M chez les cellules PC-3. Ces données sont en accord parfait avec l’augmentation de l’activité caspases observée après 48h du traitement. Enfin, à titre qualitatif, une étude de la composition chimique ainsi qu’une identification des composés bioactifs majeurs, des extraits Rm-HE, Mv-DF, Oe-DF et Oe-HE ont été réalisées par CG-MS. Ainsi, les données obtenues dans cette étude honorent le savoir-faire ancestral et apportent un vrai support scientifique à l’utilisation de ces plantes par les herboristes et les guérisseurs traditionnels, tout en offrant un point de départ imminent à plusieurs études à venir.

[eng] Plants are known for centuries for their medicinal value; that allowed the establishment of a large number of anticancer drugs with a very high efficiency. In Morocco, they play a very important role in traditional medicine, which is one of the major sources for new potentially bioactive molecules. The work presented in this thesis is a part of the national strategy, promoting Moroccan medicinal plants by developing ancestral knowledge and specific knowledge of plant species. Four medicinal plants were selected, on basis of the ethnobotanical study and according to their uses in traditional medicine. Sixteen plant extracts were screened on a panel of human cancer cell lines including cell types from solid and haematological cancers origins as well as non-transformed murine fibroblasts. Cell viability assays revealed that at least one extract from each plant was able to exert cytotoxic activity against the majority of cell lines tested, the IC50 values of the active extracts were in most cases ≤ 30 μg/ml. Next we focused on the anti-leukemic and apoptotic-inducing effects of Rm-HE, who exhibited a dramatic effect on Jurkat cells by promoting cell cycle arrest and partially JNKdependent apoptosis characterized by an increase in Fas-L levels together with activation of caspases 8, 3, 7 and 9. A detailed study of Mv-DF mechanism of action was also carried out, its effects on the distribution of cell cycle and induction of apoptosis were detected by flow cytometric analysis for both (Jurkat and Jeko-1) lines, accompanied by a sharp increase in the activity of the effector caspases 3 and 7 and a significant inhibition of anti-apoptotic proteins (Bcl-2 and Mcl-1) as well as the PARP inactivation after 48 hours of treatment. Regarding Ormenis erioplepis, cell viability measurements, have allowed us to calculate the IC50 values for the most promising extracts, particularly Oe-DF and Oe-HE on the most sensitive lines. Cytometry analysis accompanied by p-H2A.X levels monitoring, showed that both the Dichloromethane Fraction and Hexanic Extract induce DNA double stranded breaks (DSBs) accompanied by cell cycle arrest in G1 (Jurkat, Jeko-1 and LN229) and G2/M (PC-3) phases which is agreed with the caspase activity observed. A qualitative study of the chemical composition and the major bioactive compounds of Rm-HE, Mv-DF Oe-DF and Oe-HE were performed by GC-MS. Finally, the data obtained in this study should honor the ancestral knowledge and provide a real scientific support for the use of these plants by herbalists and traditional healers, while providing an immediate starting point for many future studies.