Síntesis de compuestos híbridos nanoestructurados y evaluación de su comportamiento supramolecular y actividad biológica

Abstract

[spa] Introducción: La síntesis de nanopartículas de óxidos de hierro ha experimentado un auge en los últimos años. El creciente interés en este tipo de materiales ha permitido el desarrollo de diversas metodologías sintéticas. Una de las metodologías a destacar es el método de descomposición térmica. Esta síntesis, fue la elegida en nuestro trabajo para preparar las diversas nanopartículas de Fe3O4 debido a la facilidad para modular los tamaños modificando levemente las condiciones de síntesis. El reconocimiento molecular asociado a nanopartículas ha ido en aumento en los últimos años. Específicamente en la detección de cationes se han desarrollado diversas nanopartículas funcionalizadas para reconocer metales pesados de gran impacto medioambiental. Por otra parte, el reconocimiento de aniones asociado a nanopartículas ha sido mucho menos estudiado. En general, este tipo de reconocimiento está directamente ligado a los grupos que funcionalizan las nanopartículas en cuestión. Por ello, se deben utilizar funcionalidades con propiedades adecuadas para llevarlo a cabo. Las escuaramidas son un buen ejemplo de ello ya que han utilizado para la preparación de diversos receptores supramoleculares de iones. Por otra parte, en los últimos años la utilización de nanopartículas como vehículos transportadores de fármacos ha ido en aumento, principalmente para desarrollar nuevos tratamientos para el cáncer. Esta vía propone transportar los fármacos específicamente a las células tumorales disminuyendo los efectos secundarios derivados de la quimioterapia. En esta línea se describen dos estrategias de transporte: la covalente, donde los fármacos se unen de forma covalente a las nanopartículas y la no covalente donde se establecen interacciones electrostáticas o enlaces de hidrógeno entre las funcionalidades de las nanopartículas y los fármacos a transportar.

Contenido de la investigación: A fin de evaluar el comportamiento supramolecular de nanopartículas funcionalizadas con escuaramidas, se preparó una nueva batería de di y bis-diescuaramidas asimétricas con los linkers dopamina y APTES (3-(aminopropil) trietoxisilano). Estos linkers permitieron unir covalentemente las escuaramidas a la superficie de las nanopartículas de Fe3O4 a través de los grupos fenólicos y etoxisilanos respectivamente. Las diferentes escuaramidas asimétricas fueron preparadas en condiciones suaves de reacción con rendimientos de moderados a altos y con una elevada pureza. Fueron caracterizadas a través de las técnicas típicas de caracterización: 1H-RMN, 13C-RMN, FT-IR y HRMS-ESI(+) o MALDI en función de sus solubilidades. Todas ellas fueron utilizadas posteriormente para funcionalizar nanopartículas de óxidos de hierro. Varias nanopartículas funcionalizadas con escuaramidas (NP-SQ) fueron utilizadas para evaluar su comportamiento supramolecular frente a carboxilatos e iones de metales pesados en disolución acuosa. Para llevar a cabo los diferentes ensayos se eligieron NP-SQ específicas principalmente en función de su solubilidad en disoluciones acuosas. Para estudiar el reconocimiento de carboxilatos se llevó a cabo un ensayo basado en desplazamiento competitivo de un indicador fluorescente. Se estudiaron diversos mono, di y tricarboxilatos, observándose siempre la misma tendencia. Tanto mono como dicarboxilatos eran reconocidos por las nanopartículas mientras que los tricarboxilatos no. Este resultado demostró que nanopartículas funcionalizadas con cadenas sencillas y nada preorganizadas (como las escuaramidas) eran capaces de inducir selectividad en el reconocimiento. Esta selectividad en química supramolecular suele presentarse solo con receptores altamente preorganizados y cuya preparación generalmente requiere un gran esfuerzo sintético. El reconocimiento y eliminación de metales pesados también fue estudiado con varias NP-SQ. Se demostró la elevada capacidad de retención de los metales Hg2+, Pb2+, Cu2+, Co2+, Cd2+, Zn2+ y Cr3+ que presentaban estas nanopartículas cuando dichos metales se encontraban por separado. Además, realizando un ensayo de retención con una disolución que contenía todos los metales anteriores juntos se determinó la superior afinidad que existía entre estas nanopartículas funcionalizadas y Hg2+y Pb2+. A través de ensayos por RMN, HRMS-ESI(+) y MALDI se comprobó la afinidad entre el resto escuaramídico correspondiente y los dos metales pesados. La superior interacción entre el resto escuaramídico y Hg2+y Pb2+ se relacionó con el mayor tamaño de estos dos iones en comparación con los otros estudiados. Para ambos es factible coordinación a través de los dos grupos carbonilos del anillo de escuarato. Sin embargo, para el resto de metales estudiados, su menor tamaño impide esta coordinación bidentada y solamente favorece una coordinación de tipo ɳ1. El estudio por RX de un cristal obtenido tras la complejación de la escuaramida con el Hg2+ mostró la formación de un enlace Hg-C aromático y posteriormente se comprobó que el anillo de escuarato jugaba un papel importante en la formación de este enlace. Finalmente, se utilizaron nanopartículas de Fe3O4 como transportadores de un tipo específico de fármacos anticancerígenos conocidos como antifolatos. Estos fármacos estructuralmente similares al ácido fólico (AF) pueden entrar a las células cancerígenas a través de los receptores de membrana del AF y una vez dentro de la célula actúan como inhibidores del enzima dihidrofolato reductasa y/o timidilato sintasa disminuyendo así la viabilidad celular. En el transporte de estos antifolatos se comparó la eficacia de la estrategia covalente con la no covalente. Para la estrategia covalente se sintetizaron nanopartículas con el linker APTES al que posteriormente se acoplaron los antifolatos Raltitrexato (RTX) y Pemetrexato (PTX). En cambio para la inclusión de los mismos a través de la estrategia no covalente se prepararon nanopartículas funcionalizadas con escuaramidas. La citotoxicidad de las diversas nanopartículas se evaluó frente a una línea celular humana de adenocarcinoma de pulmón con sobre-expresión de los receptores de folato (A549). Los resultados mostraron una inhibición significativa al utilizar el antifolato RTX unido covalentemente a las nanopartículas. Dicha inhibición fue superior a la observada con el fármaco libre. Con el PTX unido también de forma covalente a las nanopartículas no se observó ninguna inhibición significativa. En la estrategia no covalente, a pesar de utilizar concentraciones muy superiores a las ensayadas en la estrategia covalente no se observó una marcada citotoxicidad, lo cual se relacionó posteriormente con una menor entrada de estas nanopartículas a las células tumorales.

Conclusiones: Finalmente, se puede concluir que se las nanopartículas funcionalizadas con escuaramidas son capaces de actuar como receptores selectivos de carboxilatos e iones de metales pesados. Además, se ha demostrado que los antifolatos transportados covalentemente son una buena estrategia en la terapia anticancerígena.

[eng] In this work, different iron oxide nanoparticles were functionalized with squaramides to evaluate their supramolecular behavior against carboxylates and heavy metal ions. The coupling between the iron oxide nanoparticles and the squaramides was carried out through the use of the linkers dopamine or APTES. It was demonstrated the selective coordination of these nanoparticles to mono and dicarboxylates but not tricarboxylates, in water. The different assays performed showed how iron magnetic nanoparticles were useful platforms to build receptors capable of displaying an effective molecular recognition and to show different behavior when the same binding unit was used with another spacer. These hybrid squarate-nanoparticles were also used for the coordination of heavy metal ions in water. This material displayed a strong association with Hg2+ and Pb2+ in the presence of other heavy metals and specifically for mercury, it showed a different behavior from another described scavengers due to formation of a covalent arylmercury compound. Finally, different iron oxide nanoparticles were prepared for the delivery of antifolates into cancer cells. Antifolates, such as Raltitrexed, Pemetrexed and Methotrexate, were bound to iron oxide nanoparticles through two different strategies: a covalent union or non-covalent interactions, such as electrostatic and H-bonding. For the covalent bonding of antifolates to the surface of nanoparticles an appropriate linker (APTES) was used, while the non-covalent interaction was achieved with nanoparticles functionalized in one step with squaramides and meso 2,3-dimercaptosuccinic acid. To evaluate the effectiveness of the antifolate-derivatized nanoparticles, their cytotoxicity was assayed in A549 human lung adenocarcinoma cells. Only the administration of the covalent antifolate-functionalized nanoparticles strongly inhibited the viability of these cancer cells, whereas the delivery of antifolates bound to nanoparticles through non-covalent interactions did not exhibit significant cytotoxic effects. The present results suggest that covalent antifolate-functionalized nanoparticles could be a potentially delivery system for cancer cells expressing folate-receptors.