Efecto de las condiciones de conservación sobre las características de vesículas extracelulares

Abstract

[spa] Las vesículas extracelulares (VEs) son un conjunto heterogéneo, en cuanto al tamaño y en cuanto al proceso de biogénesis, de estructuras membranosas emitidas por una gran variedad de tipos celulares al espacio extracelular y que funcionan en la comunicación celular. Las VEs han atraído mucho el interés científico por sus potenciales aplicaciones clínicas, tanto para fines diagnósticos como para fines terapéuticos. Uno de los retos hoy en día para su uso clínico sigue siendo su conservación, si bien el almacenaje de VEs a -80 ºC es, actualmente, el método estándar que se utiliza en los laboratorios de investigación. Deben explorarse alternativas que facilitarán su uso en la práctica clínica. Por ello, el objetivo de este trabajo consiste en evaluar el efecto de las diferentes condiciones de conservación sobre las características de las VEs. Para ello, se obtuvieron VEs a partir de medio condicionado de células mediante centrifugación diferencial, filtración tangencial y cromatografía de exclusión por tamaño. Se evaluaron cuatro condiciones experimentales diferentes: -80 ºC en PBS, -80 ºC en Trehalosa, Liofilizada en PBS, Liofilizada en Trehalosa. Estas fracciones fueron utilizadas para su caracterización y para la realización de un análisis funcional. Las VEs fueron caracterizadas en función de la morfología, tamaño, número de partículas, contenido en proteína y pureza. Se observó como en todas las condiciones experimentales las VEs se mantuvieron estables y sin indicios de agregación o lisis. Finalmente se confirmó la presencia de la tetraspanina CD9 que caracteriza a las VEs en todos los grupos. A continuación, se quiso evaluar si las condiciones de conservación influían en la bioactividad y funcionalidad de las VEs aisladas, por lo que se llevó a cabo un ensayo funcional. Para ello se evaluó la fosforilación de la proteína ERK, implicada en la vía de señalización MAPK/ERK, después del tratamiento con VEs. Si bien los resultados obtenidos no son conclusivos, sí que indican que la liofilización parece ser un método favorable para el mantenimiento de la bioactividad de las VEs.

[eng] Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous group, in terms of size and biogenesis, of membranous structures secreted by a wide variety of cell types to the extracellular space and that exert a cellular communication function. The EVs have attracted much scientific interest for their potential clinical applications, both for diagnostic and for therapeutic purposes. One of the challenges today for its clinical use is still its conservation, although storage at -80 ºC is currently the standard method used in research laboratories. Alternatives should be explored in order to facilitate their use in clinical practice. Therefore, the aim of this work was to evaluate the effect of different conservation conditions on the EVs characteristics. Thus, EVs were obtained from conditioned cell media by differential centrifugation, tangential filtration and size exclusion chromatography. Four different experimental conditions were evaluated: -80 ºC in PBS, -80 ºC in Trehalosa, lyophilized in PBS, lyophilized in Trehalose. These fractions were used for their characterization and for the performance of a functional analysis. The EVs were characterized according to the morphology, size, number of particles, protein content and purity. It was observed that in all the experimental conditions the EVs remained stable and without signs of aggregation or lysis. Finally, the presence of the tetraspanin CD9 that characterizes the EVs was confirmed in all the experimental groups. Next, we wanted to evaluate if the conservation conditions influenced the bioactivity and functionality of the isolated EVs, so a functional test was carried out. To this end, the phosphorylation of the ERK protein, involved in the MAPK / ERK signaling pathway, was evaluated after treatment with EVs. Although the results obtained are not conclusive, they do indicate that lyophilization seems to be a favorable method for maintaining the bioactivity of EVs.