[eng] Today is known that RNA does more functions than previously thought. Riboswitches are RNA
molecules situated in the 5’-UTR (untranslated region), which are able to regulate gene
expression via changing the RNA conformation upon interaction with a specific metabolite.
These molecules have been postulated as good antibiotic targets as they regulate crucial
metabolic pathways. Riboswitches consist of two domains; the aptamer where the metabolite
is bound and the expression platform, which is the part that finally causes the gene expression
regulation. The most common regulation mechanisms used are the transcription termination
and the translation inhibition.
A presumable btuB riboswitch sequence has been bioinformatically found in the genome of
Klebsiella pneumoniae and has been proposed as a B12 riboswitch candidate. In our study, in-line
probing experiments have been performed in order to validate the sequence as a riboswitch. A
RNA conformational change has been observed in the RNA sequence upon interaction with
AdoCbl. In the gene-on conformation, the ribosome binding site (RBS) is free and the btuB gene
can be expressed. In contrast, after the metabolite interaction, the RNA is shifted to the geneoff conformation in which the RBS is masked in a base paired region. This fact proves the
sequence as a riboswitch and suggests a translation inhibition mechanism.
Then, thermodynamic parameters have been recorded using the isothermal titration
calorimetry (ITC) experiments. Two different constructs were used: MB01 which contain the
aptamer (214 nt.) and JP01 carrying both the aptamer and the expression platform (243 nt.).
Titrations using AdoCbl as titrant were performed for both constructs at different temperatures
ranging from 15 °C to 30 °C. Taking the results together we could say that the RNA-AdoCbl
interaction is exothermic and follows a 1:1 stoichiometry. The enthalpy obtained at 25 °C is
-119±3 kJ/mol for JP01 and -122.7±0.9 kJ/mol for MB01. These enthalpy values are in
consonance with a sum of several weak interactions such as H-bond and π staking. The KD values
for MB01 (770±90 nM at 25 °C) are higher than those obtained for JP01 (530±50 mM at 25 °C)
in the entire temperature range. Thus, we can conclude that the presence of the expression
platform in JP01 stabilizes the interaction of the btuB riboswitch with the AdoCbl. The inhibition translation mechanism was also proved by coupling the riboswitch to a red
fluorescent protein (mCherry). The protein synthesis was inhibited after increasing amounts of
AdoCbl were added to the culture media. Recently, there is a growing research interest in ligand analogues that are tested for antibiotic
potential through riboswitch inhibition. With the aim to synthetize an antivitamin of Cbl, a
culture of Allocromation vinosum has been anaerobically grown in a deficient cobalt medium. In
these conditions, these purple sulphur bacteria are able to synthetize descobaltocobalamins and
their derivatives. After cultivating 900 l of bacteria and collecting their cell pellet, we have been
able to extract and purify 4mg of descobaltocobalamin and 2 mg of descobaltocobyric acid.
[cat] Avui en dia es sabut que l’ARN pot fer més funcions de les que inicialment li eren assignades. Els
ribocommutadors són molècules d’ARN situades a la regió no traduïda de l’extrem 5’ (5’-UTR).
Aquestes molècules, després d’interaccionar amb el seu metabòlit específic provoquen un canvi
conformacional que és el responsable de la regulació génica. Els ribocommutadors s’han
postulat com bones dianes per antibiòtics ja que regulen rutes metabòliques crucials. Els
ribocommutadors contenen dos dominis, l’aptamer, que és el lloc d’unió del metabòlit, i la
plataforma d’expressió, que és la part responsable de la regulació. Els mecanismes de regulació
més comuns són la terminació de la transcripció i la inhibició de la traducció.
Un presumible btuB ribocommutador ha estat identificat bionformàticament al genoma de
Klebsiella pneumoniae i postulat com a ribocommutador de B12. Al nostre estudi, s’han realitzat
experiments d’in-line probing per tal de validar la seqüencia com a ribocommutador. Un canvi
conformacional a l’ARN ha estat detectat després de la interacció del ribocommutador amb el
coenzim B12. An la conformació de gen-on, la zona d’unió amb el ribosoma (RBS) està lliure i el
gen btuB pot esser expressat. Per contra, després de l’interacció amb el metabòlit, la
conformació del ARN passa a ser gen-off, on la RBS forma part d’una regió d’aparellament de
bases que impedeix l’accés al ribosoma. Aquests fets proven que aquesta seqüència és un
ribocommutador de B12 i suggereix que el mecanisme de regulació és per inhibició de la
traducció.
Per altra banda, els paràmetres termodinàmics han estat calculats mitjançant valoracions de
calorimetria isoterma (ITC). Per a aquest experiment es van usar dues seqüències diferents:
MB01 que conté només l’aptamer (214 nt.) i la seqüència JP01 que conté l’aptamer i la
plataforma d’expressió (246 nt.). A les valoracions calorimètriques s’ha usat AdoCbl com a
valorant i s’han fet mesures en un rang de temperatures d’entre 15 °C a 30 °C per a les dues
seqüències. Amb els resultats obtinguts es pot dir que la interacció entre l’ARN i AdoCbl és
exotèrmica i segueix una estequiometria 1:1. L’entalpia de la interacció a 25 °C és de -119±3
kJ/mol per JP01 i de -122,7±0,9 kJ/mol per MB01. Aquests valors d’entalpia estan d’acord amb
que la interacció és el resultat de la suma d’interaccions febles de tipus enllaç d’hidrogen o
d’apilament. Els valors de KD obtinguts per MB01 (770±90 nM a 25 °C) són sempre més elevats
que per JP01 (530±50 mM a 25 °C) a tot l’interval de temperatures. Per tant, es pot arribar a la
conclusió que la plataforma d’expressió present a la seqüència JP01 té alguna funció en
l’estabilització de la interacció del btuB riboswitch amb AdoCbl. El mecanisme de regulació per inhibició de la traducció ha estat validat fent un acoblament del
ribocommutador amb una proteïna fluorescent vermella (mCherry), ja que la síntesi de la
proteïna fluorescent s’inhibeix quan s’incrementa la concentració de cobalamina al medi de
cultiu.
Recentment, la recerca en el camp s’ha centrat en la modificació dels metabòlits que regulen els
ribocommutadors, ja que s’han postulat com possibles antibiòtics degut a la inhibició de la
funció dels ribocommutadors. Amb el propòsit de sintetitzar una antivitamina de cobalamina,
s’ha fet créixer un cultiu d’Allocromatium vinoum en condicions anaeròbiques i de dèficit de
cobalt. En aquestes condicions, aquests bacteris sintetitzen descobaltocobalamines i els seus
derivats. Després de fer créixer 900 l de cultiu i recollir les pellets de cèl·lules, hem estat capaços
d’extreure i purificar 4 mg de descobaltocobalamina i 2 mg d’àcid descobaltocobíric
[spa] Hoy dia es bien sabido que el ARN lleva a cabo más funciones que las que inicialmente se le
asignaron. Los riboswitches son moléculas de ARN situadas en la región no traducida del
extremo 5’ (5’-UTR). Dichas moléculas, después de interaccionar con su metabolito específico,
provocan un cambio conformacional que es el responsable final de la regulación génica y, por
ello, han sido postulados como buenas dianas para antibióticos, ya que regulan rutas
metabólicas essenciales. Los riboswitches contienen dos dominios, el aptámero, donde se une
el metabolito y la plataforma de expresión responsable de la regulación. Los mecanismos de
regulación más comunes son la terminación de la transcripción y la inhibición de la traducción.
Un presumible btuB riboswitch ha sido bioinformáticamente identificado en el genoma de
Klebsiella pneumoniae y postulado como riboswitch de B12. En nuestro estudio, se han realizado
experimentos de in-line probing para validar la secuencia como riboswitch. Un cambio
conformacional del RNA ha sido detectado después de la interacción entre el riboswitch con
AdoCbl. En la conformación gen-on, la zona de unión con el ribosoma (RBS) está libre y el gen
btuB puede ser expresado. En cambio, después de la interacción con el metabolito, la
conformación del ARN pasa a ser gen-off en la que el RBS forma parte de una región de
apareamiento de bases que impide el acceso al ribosoma. Estos echos prueban que esta
sequencia es un riboswitch de B12 y sugiere un mecanismo de regulación por inhibición de la
traducción.
Por otra parte, los parámetros termodinámicos han sido calculados mediante valoraciones
calorimétricas isotermas (ITC). Dos secuencias diferentes han sido usadas: MB01 que continene
el aptámero (214 nt.) y la secuencia JP01 que contiene el aptámero y la plataforma de expresión
(246 nt.) En las valoraciones calorimétricas se ha usado la AdoCbl como valorante y se han
realizado diferentes medidas entre 15 °C y 30 °C para ambas secuencias. Con los resultados
obtenidos se puede decir que la interacción entre el ARN y la AdoCbl es exotérmica y que sigue
una estequiometria 1:1. La entalpía de la interacción a 25 °C es de -119±3 kJ/mol para JP01 y de
-122,7±0,9 kJ/mol para MB01. Estos valores de entalpía concuerdan con el hecho de que la
interacción se produce a través de la suma de interacciones débiles, como el enlace de
hidrógeno o el apilamiento. Los valores de KD obtenidos para MB01 (770±90 nM a 25 °C) son
siempre mayores que los de JP01 (530±50 mM a 25 °C) en todo el intervalo de temperatures.
Por tanto, se puede llegar a la conclusión de que la plataforma de expressión presente en la
secuencia JP01 tiene alguna función en la estabilización de la interacción del btuB riboswitch con
AdoCbl. El mecanismo de regulación por inhibición de la traducción ha sido validado acoplando el
riboswitch a una proteína roja fluorescente (mCherry) y, de echo, la síntesis de la proteína
fluorecente se inhibe cuando se incrementa la concentración de cobalamina en el medio de
cultivo.
Recientemente, la investigación en el campo se ha centrado en la modificación de los
metabolitos que regulan los riboswitches, ya que se han postulado como posibles antibióticos
debido a la inhibición de la función del riboswitch. Con el propósito de sintetitzar una
antivitamina de cobalamina, un cultivo de Allocromatium vinoum se ha hecho crecer en
condiciones anaeróbicas y de décifit de cobalto. En estas condiciones, estas bacterias sintetizan
descobaltocobalaminas y sus derivados. Después de cultivar 900 l de cultivo y recoger las pellets
de las células, hemos sido capaces de extraer y purificar 4 mg de descobaltocobalamina y 2 mg
de ácido descobaltocobírico.