Development of squaramide-based self-immolative spacers for drug delivery

Abstract

[eng] This PhD thesis entitled “Squaramide-Based Self-Immolative Spacers for Drug Delivery” describes the development of squaramide spacers able to undergo triggereddisassembly for the release of bioactive compounds. As a starting point, we synthesised a small collection of squaramate esters to study their hydrolytic stability in biologically simulated conditions. These compounds bear different side chains with chemical functionalities that may assist the hydrolysis or cyclization reaction. The kinetic study has permitted to find that the propanediamino and the ethyl sulphur side chains successfully undergo the cyclization reaction releasing ethanol as the leaving group. Based on the results found for squaramate ester derivatives, we designed and synthesized squaramide-based self-immolative models bearing amines as the leaving group. We explored both anilines and aliphatic amines to this purpose. The kinetic study revealed that the rate of disassembly was strongly dependent on the pH and the nucleofugacity of the leaving group. Henceforth the release of anilines was faster than n-butylamine. Additionally, N-methylated models showed faster cyclization rates and better aqueous solubility. Overall, the most suitable squaramide-based self-immolative linker should present the following key features: 1) Propanediamino chain as the nucleophile 2) Aniline as the chemical nature of the leaving group or cargo 3) Nmethylation of the squaryl ring. As proof of concept, we applied the optimised design in the synthesis of a prodrug. We selected the p-nitrobenzyl carbamate residue as the trigger group and phenylenediamine mustard as the active drug. The disassembly process was enzymatically triggered by a nitroreductase using NADH as the reductive agent. We tested the biological activity of the prodrug against glioblastoma cancer cells. The clonogenic assay performed with LN229 cells showed that the treatment with the parent mustard drug had no effect on the cell growth but, when treated with the mustard prodrug, we could observe the significant decrease in the survival factor (down to 24 %). This result was outstanding since the treatment with temozolomide, a common antitumor agent used in the treatment of brain cancer, showed a survival factor of 58 %.

[spa] Esta tesis, titulada “Espaciadores Autoinmolativos de base Escuaramida para la Administración de Fármacos” describe el desarrollo de espaciadores derivados de escuaramida capaces de desensamblarse para liberar compuestos bioactivos. En primer lugar, se han sintetizado una colección de escuaramato ésteres y se ha estudiado su estabilidad hidrolítica en condiciones fisiológicas. Estos compuestos presentan diferentes grupos funcionales en la cadena lateral que pueden asistir la reacción de hidrólisis o la ciclación. El estudio cinético ha permitido determinar que los compuestos con cadenas de propandiamina y etilsulfuro son capaces de llevar a cabo la reacción de ciclación, liberando etanol como grupo saliente. En base a estos resultados, se han diseñado y sintetizado modelos autoinmolativos de base escuaramida para el estudio de liberación de aminas como grupo saliente. Se han considerado tanto anilinas como aminas alifáticas. Los estudios cinéticos han demostrado la dependencia de la autoinmolación con el pH y la nucleofugacidad del grupo saliente, encontrando velocidades de liberación mayores en anilinas respecto a las aminas alifáticas. Así mismo, se ha observado que los modelos N-metilados presentan cinéticas de liberación más rápidas y son más solubles en medio acuoso. De estos estudios se determinan los atributos clave para el diseño de sistemas autoinmolativos: 1) el uso de la cadena de propandiamina como nucleófilo 2) el uso de anilinas como grupo saliente del compuesto de interés 3) N-metilación del nitrógeno escuaramídico. Como prueba de concepto, el módulo autoinmolativo optimizado se ha introducido en la síntesis de un profármaco. Éste consta del p-nitrobencil carbamato como grupo protector (gatillo) y un derivado de mostaza de nitrógeno como fármaco. El proceso de autoinmolación se ha activado por efecto de la enzima nitroreductasa usando NADH como agente reductor. La actividad biológica del profármaco y la mostaza se ha probado frente a células cancerosas de glioblastoma mediante un ensayo clonogénico con células LN229. Mientras que la mostaza no presenta efecto sobre la proliferación celular, el profármaco reduce el factor de supervivencia del cultivo al 24 %. Este resultado es muy significativo ya que, el ensayo con temozolomida, un antitumoral comúnmente usado en el tratamiento de tumores cerebrales, presenta un factor de supervivencia del 58 %. Además de la línea principal de esta tesis, el estudio de los productos de autoinmolación (cicloescuaramidas) ha llevado a la formación de cristales en agua. Se ha visto cómo el grado de metilación influye en la formación de tres tipos de redes de agua en la estructura: cintas, capas bidimensionales hexagonales y cadenas monodimensionales.

[cat] Aquesta tesi, titulada “Espaiadors Autoimmolatius de base Esquaramida per a l’Administració de Fàrmacs” descriu el desenvolupament d’espaiadors derivats d’esquaramida capaços de desencadellar-se per alliberar composts bioactius. En primer lloc, s’ha sintetitzat una col·lecció d’esquaramat èsters y s’ha estudiat la seva estabilitat hidrolítica en condicions fisiològiques. Aquests composts presenten diferents grups funcionals a la cadena lateral que poden assistir la reacció d’hidròlisi o la ciclació. L’estudi cinètic ha permès determinar que els composts amb cadenes de propandiamina i etilsulfur son capaços de dur a terme la reacció de ciclació alliberant etanol como grup sortint. En base a aquests resultats, s’han dissenyat i sintetitzat models autoimmolatius de base esquaramida per a l’estudi d’alliberament d’amines como a grup sortint. S’han considerat tant anilines como amines alifàtiques. Els estudis cinètics han demostrat la dependència de l’autoimmolació amb el pH i la nucleofugacitat del grup sortint, trobant velocitats d’alliberament majors per anilines respecte les amines alifàtiques. Així mateix, s’ha observat que els models N-metilats presenten cinètiques d’alliberament més ràpides i son més solubles en medi aquós. D’aquests estudis es conclouen els atributs clau per al disseny de sistemes autoimmolatius: 1) l’ús de la cadena de propandiamina com a nucleòfil 2) l’ús d’anilines como grup sortint del compost d’interès 3) N-metilació del nitrogen esquaramídic. Com a prova de concepte, el mòdul autoimmolatiu optimitzat s’ha introduït a la síntesis d’un profàrmac. La seva estructura consta del p-nitrobenzil carbamat com a grup protector (gallet) i un derivat de mostassa de nitrogen com a fàrmac. El procés d’autoimmolació s’ha activat mitjançant l’acció de l’enzim nitroreductasa fent servir NADH com agent reductor. L’activitat biològica del profàrmac i de la mostassa s’ha provat front cèl·lules canceroses de glioblastoma mitjançant un assaig clonogènic amb cèl·lules LN229. Mentre que la mostassa no presenta efecte sobre la proliferació cel·lular, el profàrmac redueix el factor de supervivència del cultiu al 24 %. Aquest resultat és molt significatiu ja que, l’assaig amb temozolomida, un antitumoral molt usat en el tractament de tumors cerebrals, presenta un factor de supervivència del 58 %. A més de la línia principal d’aquesta tesi, l’estudi dels productes d’autoimmolació (cicloesquaramides) ha dut a la formació de cristalls en aigua. S’ha vist com el grau de metilació influeix en la formació de tres tipus de xarxes d’aigua a l’estructura: cintes, capes bidimensionals hexagonals y cadenes monodimensionals.