In vitro dynamics and mechanisms of resistance development to imipenem and imipenem/relebactam in Pseudomonas aeruginosa

Abstract

[eng] Pseudomonas aeruginosa, is a major cause of nosocomial and chronic infections, being considered a paradigm of antimicrobial resistance development. However, in the present study the dynamics and mechanisms of resistance development to imipenem and imipenem/relebactam in wild-type (PAO1) and mutator P. aeruginosa (PAOMS, ΔmutS) have been compared. The strains were incubated in Müeller-Hinton Broth (MHB) for 24h with 0.125 to 64 µg/mL of imipenem, and imipenem/relebactam at 4 µg/mL fixed concentration. The tubes from the highest antibiotic concentration showing growth were reinoculated in fresh medium containing concentrations up to 64 µg/mL of imipenem for 7 consecutive days. The susceptibility profiles and resistance mechanisms were assessed for 40 derived mutants from PAO1 and 40 from PAOMS. Those mutants were further characterized by whole-genome sequencing (WGS) through DNA isolation, and its virulence studied by Caenorhabditis elegans model. Development of high-level imipenem resistance development was faster for PAOMS than PAO1 mutants. Furthermore, when both strains were treated with imipenem/relebactam, development resistance to imipenem was reduced. Moreover, characterization of mutants by WGS indicated that most of mutants which were resistant to imipenem, had mutations on oprD and ampC, while imipenem/relebactam resistant mutants had mutations in oprD and MexAB-OprM efflux system genes. Additionally, virulence and lethality of PAO1 and PAOMS mutants tested by C. elegans model demonstrated that those more resistant mutants were non-virulent, and the more sensitive ones were considered virulent. Those results suggested relebactam as an adequate partner for imipenem to remedy infections caused by P. aeruginosa resistant to carbapenems.

[spa] P. aeruginosa es una de las mayores causas de infecciones nosocomiales y crónicas, siendo un paradigma del desarrollo de resistencias a antibióticos. Así pues, en el presente estudio se compara la dinámica y el desarrollo de mecanismos de resistencia a imipenem e imipenem/relebactam en cepas de P. aeruginosa PAO1, así como de P. aeruginosaΔmutS conocida como PAOMS. Ambas cepas fueron incubadas en caldo Müeller-Hinton por separado durante 24h, a una concentración creciente de imipenem de 0.125 a 64 µg/mL, e imipenem/relebactam a concentración constante de este último de 4 µg/mL. Los tubos de mayor concentración de antibiótico con crecimiento visible fueron reinoculados en medio fresco con concentraciones superiores de imipenem, repitiéndose el mismo procedimiento durante 7 días consecutivos. Los perfiles de sensibilidad y mecanismos de resistencia se estudiaron de cada uno de los mutantes obtenidos, siendo caracterizados por secuenciación del genoma entero a partir del aislamiento de ADN. Además, su virulencia fue estudiada mediante la infección del modelo C. elegans. En los resultados se observó que los mutantes derivados de PAOMS desarrollaron resistencia a imipenem antes que los derivados de PAO1 cuando habían sido sometidos a presión selectiva con este mismo antibiótico. Asimismo, cuando ambas cepas fueron tratadas con imipenem/relebactam, el desarrollo de resistencia frente a imipenem fue reducido. La caracterización de los mutantes mediante la secuenciación del genoma entero resaltó que los mutantes resistentes a imipenem poseían mutaciones en los genes relacionados con la hiperproducción de la cefalosporinasa AmpC y la porina OprD, en cambio, aquellos mutantes resistentes a imipenem/relebactam demostraron mutaciones en el sistema de eflujo MexAB-OprM así como también en oprD. Finalmente, el estudio de la virulencia en C. elegans demostró que aquellos mutantes más resistentes fueron menos virulentos, e inversamente los mutantes menos resistentes resultaron virulentos. Estos resultados sugieren que el relebactam es la combinación más adecuada junto con el imipenem para remediar infecciones causadas por P. aeruginosa resistente a carbapenémicos.