Role of membrane lipids in colon differentiation unravelled by mass spectrometry imaging: arachidonic acid beyond inflammation

Abstract

[cat] La presència de milers d'espècies de lípids en la natura (a dia d'avui al voltant de 21500 espècies moleculars) fa qüestionar el perquè la vida necessita aquesta gran varietat si per generar membranes bastarien unes quantes espècies. L'estudi sistemàtic del lipidoma ha ajudat a definir els lípids no només com a blocs de construcció i proveïdors de l'ambient necessari per fer funcionar les proteïnes, sinó a més com a participants en múltiples processos biològics i com a precursors d'altres molècules senyal. En aquesta tesi, hem aprofitat els darrers avenços en tècniques d'anàlisi de lípids per estudiar els canvis que es donen en la fisiopatologia del colon i per identificar nous potencials biomarcadors de càncer colorectal (CCR). Amb l'anàlisi lipídica de línies comercials per HPLC acoblada a espectrometria de masses, hem demostrat que el lipidoma era capaç de distingir entre cèl•lules primàries sanes i línies cel•lulars de càncer colorectal. A més, comprovarem les diferències en composició lipídica en talls histològics de teixit humà usant tècniques d'imatge acoblada a espectrometria de masses (IMS). Aquesta tècnica permet descriure en dues dimensions la distribució dels lípids al llarg de les seccions histològiques. Les imatges obtingudes mostraren que el lipidoma era suficientment sensible per discriminar primer entre les diferents cèl•lules que conformen la mucosa del colon, i després entre el teixit sà i tumoral. Entre els múltiples canvis detectats, fou remarcable com les espècies que contenien àcid araquidònic (AA) eren usades de forma diferent entre les cèl•lules epitelials i les estromals. Mentre que l'AA canviava al llarg de la cripta en funció del seu estat de diferenciació, al llarg de l'estroma els canvis concordaven en la resposta immunològica que es dona fisiològicament en el colon sà. Per tal d'aprofundir en el paper del metabolisme de l'AA en processos de diferenciació i proliferació, usarem organoides de colon per investigar com els canvis en el metabolisme de les prostaglandines podria influir en el desenvolupament dels colonòcits. Donada la sensibilitat mostrada pel lipidoma en la fisiopatologia de les cèl•lules del colon, a continuació explorarem la possibilitat d'usar la composició lipídica de vesícules extracel•lulars (EVs) com a biomarcadors no invasius. Confirmàrem que la composició lipídica d'aquestes vesícules era suficientment sensible per estratificar-les depenent de la seva cèl•lula d'origen en sistemes model i d'acord amb el grup de pacients corresponent (sans vs. pòlips adenomatosos/neoplàsies invasives). Aquestes anàlisis mostraren que la composició lipídica de EVs aïllades de plasma de pacients reflectien el desenvolupament de tumors a una proporció significativa de pacients amb tumors al colon. En resum, aquesta tesi prova que el lipidoma és altament sensible a l'estat fisiopatològic de les cèl•lules en el colon, establint les anàlisis lipídiques exhaustives com una eina viable i reproduïble capaç de detectar estats patològics com el càncer colorectal. A més, aquest estudi proporcionà evidències sòlides per investigar el metabolisme lipídic com a font de noves dianes terapèutiques.

[spa] La presencia de miles de especies de lípidos en la naturaleza (a día de hoy alrededor de 21500 especies moleculares) hace cuestionar el porqué la vida necesita esta gran variedad si para generar membranas bastarían unas pocas espécies. El estudio sistemático del lipidoma ha ayudado a definir los lípidos no solo como bloques de construcción y proveedores del ambiente necesario para hacer funcionar las proteínas, si no además como participantes en múltiples procesos biológicos y como precursores de otras moléculas señal. En esta tesis, hemos aprovechado los últimos avances en técnicas de análisis de lípidos para estudiar los cambios que se dan en la fisiopatología del colon y para identificar nuevos potenciales biomarcadores de cáncer colorectal (CCR). Con el análisis lipídico de líneas comerciales por HPLC acoplada a espectrometría de masas, hemos demostrado que el lipidoma era capaz de distinguir entre célular primárias sanas y líneas celulares de cáncer colorectal. Además, comprobamos las diferencias en composición lipídica en cortes histológicos de tejido humano usando técnicas de imagen acopladas a espectrometría de masas (IMS). Esta técnica permite describir en dos dimensiones la distribución de los lípidos a lo largo de secciones histológicas. Las imágenes obtenidas mostraron que el lipidoma era suficientemente sensible para discriminar primero entre las diferentes célular que conforman la mucosa del colon, y depsués entre el tejido sano y el tumoral. Entre los múltiples cambios detectados, fue remarcable como las especies que contenían ácido araquidónico (AA) eran usadas de forma diferente entre las células epiteliales y las estromales. Mientras que el AA cambiaba a lo largo de la cripta en función de su estado de diferenciación, a lo largo del estroma los cambios concordaban con la respuesta inmunológica que se da fisiológicamente en el colon sano. Para profundizar en el papel del metabolismo del AA en procesos de diferenciación y proliferación, usamos organoides de colon para investigar como los cambios en el metabolismo de las prostaglandinas podría influir en el desarrollo de los colonocitos. Dada la sensibilidad mostrada por el lipidoma en la fisiopatología de las células del colon, a continuación exploramos la posibilidad de usar la composición lipídica de vesículas extracelulares (EVs) como biomarcadores no invasivos. Confirmamos que la composición lipídica de estas vesículas era suficientemente sensible para estratificarlas dependiendo de su origen celular en sistemas modelo y de acuerdo con el grupo de pacientes correspondiente (sanos vs. pólipos adenomatosos/neoplásias invasivas). Estos análisis mostraron que la composición lipídica de EVs aisladas de plasma de pacientes reflejaban el desarrollo de tumores a una proporción significativa de pacientes con tumor en el colon. En resumen, esta tesis prueba que el lipidoma es altamente sensible al estado fisiopatológico de las células en el colon, estableciendo los análisis de lípidos eshaustivos como una herramienta viable y reproducible capaz de detectar estados patológicos como el cáncer colorectal. Además, este estudio proporcionó evidencias sólidas para investigar el metabolismo lipídico como una fuente de nuevas dianas terapéuticas.

[eng] The presence of thousands of lipid species in nature (to date around 21500 molecular species) opens the question of why life needs this high variety if to generate membranes only a few species are really needed. The systematic study of the lipidome has helped in defining lipids not just as building blocks and providers of the right environment for proteins to function, but also as direct participants in many biological processes and as precursors of other signaling molecules. In this thesis, we took advantage of the last advances in lipid analytical techniques to study the lipid changes occurring in colon pathophysiology and to identify potential new lipid biomarkers for colorectal cancer (CRC). Analyzing commercial cell lines lipidome by HPLC-mass spectrometry, we demonstrated that the lipidome was able to distinguish between healthy primary and CRC cell lines. Further, we assessed the difference in lipid composition in human tissue sections, analyzing them by imaging mass spectrometry techniques (IMS). This technique allows describing two-dimensionally the lipid distribution along tissue sections. The images obtained showed that the lipidome was sensitive enough to discriminate between the different cell types conforming colon mucosa first, and then between healthy and tumor tissue. Among the multiple changes detected, it was remarkable how different arachidonic acid (AA) species were handled by the epithelial cells compared to stromal cells. While AA changed precisely along the colon crypt according to the differentiation state of the epithelial cells, in the stroma, the changes surfaced the immunological response naturally occurring in a healthy colon. In order to delve into the role of AA metabolism in proliferation and differentiation processes, we used colon organoids to investigate how changes in prostaglandins (PG) metabolism influenced colonocytes development. Given the sensitivity showed by the lipidome to the pathophysiological state of colon cells, we next explored the possibility of using the lipid composition of extracellular vesicles (EVs) as non-invasive biomarkers. We confirmed that the lipid composition of these vesicles was sensitive enough to stratify them according to their cell of origin in model systems and according to the patients group (healthy vs. adenomatous polyps/invasive neoplasia). These analyzes showed that the lipid composition of plasma-derived EVs reflects the colon tumor development by a significant proportion of patients with colon tumors. In summary, this thesis proved that the lipidome is highly sensitive to the pathophysiological state of cells in the colon, establishing the comprehensive lipid analysis as a feasible and reliable tool to detect pathological states as CRC. Furthermore, this study provided solid evidence to investigate lipid metabolism as a source of potential new drug targets.