Síntesis y caracterización de poliaminoescuaramidas: estudios de agregación y actividad biológica

Abstract

[spa] La terapia génica persigue tratar enfermedades y desórdenes de origen genético. Una extensión trascendente de la terapia génica es la corrección génica que se logra usando sistemas de tipo CRISPR/Cas9. En esencia, ambas técnicas se basan en la inserción de material genético exógeno a nivel celular con el fin de modificar la correspondiente expresión proteica. Aunque el potencial de desarrollo de las terapias génicas es enorme, existen obstáculos importantes que impiden un uso clínico habitual de dichas terapias. Entre estos, son particularmente importantes los riesgos asociados a la bioseguridad y a la falta de efectividad de los tratamientos. A nivel experimental, la inserción celular de cualquier tipo de ADN requiere la utilización de vectores de transfección. En esta labor, se utilizan vectores virales que poseen elevada efectividad, pero introducen riesgos biológicos. Como alternativa, se están desarrollando vectores de tipo químico que, en general, presentan un menor riesgo biológico, pero cuya efectividad es limitada. Esta Tesis Doctoral, titulada “Síntesis y caracterización de poliaminoescuaramidas: estudios de agregación y actividad biológica”, parte de la experiencia previa sobre el comportamiento de escuaramidas y γ-aminoescuaramidas y describe por primera vez la síntesis de polímeros de base escuaramida como vectores de transfección. Se denomina transfección al transporte de material genético exógeno, en forma de plásmido u otras herramientas, al interior de células eucariotas. Se describe también su aplicación para la inserción efectiva de material genético sobre una variedad de organismos unicelulares incluyendo células humanas, protistas y bacterias. La Tesis se divide en ocho capítulos, que se han ido desarrollando siguiendo un flujo de trabajo temporal, ya que los objetivos de cada capítulo derivan de los resultados obtenidos en el capítulo anterior. En los dos primeros capítulos, se introduce al lector sobre las características estructurales de las escuaramidas, su capacidad de interacción con otras moléculas y las aplicaciones que surgen en diversos campos. En definitiva, se reconoce en el núcleo "escuaramida" un componente de pequeño tamaño, con carácter aromático y una elevada capacidad de interacción vía enlaces hidrógeno, con ciertas características peptidomiméticas y con baja toxicidad celular. Un conjunto de propiedades idóneas para el desarrollo del objetivo primordial de la Tesis, que es el de desarrollar un nuevo vector de transfección químico que reúna efectividad y baja toxicidad celular. En el capítulo 3, se describen los experimentos realizados sobre un oligómero cíclico de dos unidades escuaramida (MC2). Los experimentos previos a la Tesis parecían indicar que este compuesto podía presentar actividad transfectiva. Aunque el estudio recogido en esta Memoria, ha descartado cualquier tipo de actividad en este sentido. El compuesto MC2, del que se ha logrado su estructura de rayos X, puede presentar varias conformaciones. En este capítulo se describe la síntesis de una variante de MC2 soluble en disolventes apolares. El estudio realizado, en base a múltiples experimentos UV-Vis y RMN a temperatura y concentración variables, ha permitido descubrir hasta tres tipos de agregación y se ha demostrado la compleja interrelación que existe entre los distintos estados agregados. El capítulo 4 profundiza en la idea inicial, en el sentido de que las oligoescuaramidas cíclicas podrían poseer actividad transfectiva. El capítulo describe la síntesis de oligoescuaramidas cíclicas de una a ocho unidades escuaramida (MC1-MC8). A las técnicas habituales, la caracterización de la serie incorpora análisis mediante cromatografía de permeación de gel (GPC) con detección mediante índice de refracción (RI), espectroscopia UV-Vis y espectrometría de masas (MS). Los cromatogramas GPC prueban la pureza de los oligómeros MC1 a MC4 pero al mismo tiempo han permitido descubrir que los macrociclos superiores (MC5 a MC8) contienen proporciones variables de otros oligómeros y además, especialmente en MC7 y MC8, se detecta la formación de un material desconocido de elevado peso molecular. La evaluación de la actividad transfectiva de la serie indica cierta actividad transfectiva asociada a MC7 y MC8. En ningún caso se observa toxicidad celular reseñable. En el capítulo 5, se plantea directamente qué polímeros de base escuaramida podrían ser responsables de la transfección. En este capítulo se describen varios procedimientos para la síntesis de polímeros de tipo poliaminoescuaramida (pASQUA) y su separación mediante precipitación fraccionada o mediante filtración centrífuga fraccional. La caracterización espectroscópica, el análisis GPC de las distintas fracciones, las medidas de espectroscopia RMN de difusión (DOSY) y la correspondiente evaluación biológica, ha permitido descubrir que la actividad transfectiva de las escuaramidas se origina en polímeros de masa molecular > de 3 kDa, que contienen alrededor de un centenar de unidades γ-aminoescuaramidas. Los polímeros pASQUA son químicamente estables (2 > pH > 8) y solubles en medios acuosos ligeramente ácidos. El capítulo 6 se encuentra en la interfase de la química y la biología. En este capítulo se estudia la interacción pASQUA::ADN utilizando plásmidos y otros ácidos nucleicos. Se describen imágenes de los poliplejos obtenidas por microscopía de fuerzas atómicas (AFM) combinadas con mediciones de potencial zeta y diámetro hidrodinámico realizadas mediante dispersión dinámica de luz (DLS). Todo ello junto con los experimentos de desplazamiento de indicadores fluorescentes (FID) y siempre con la evaluación biológica ha demostrado la elevada capacidad de transfección de los polímeros pASQUA. Algunos experimentos de transfección sobre organismos unicelulares realizados con éxito con pASQUA incluyen: protistas unicelulares (Trypanosoma cruzi) formas epimastigote y amastigote. Monocercomonides (para los que no existe ningún método efectivo de transfección). Transformación extracelular de bacterias (Mycobacterium tuberculosis). Transformación intracelular de bacterias (Rickettsia canadensis y Orientia tsutsugamushi) en células VERO. Transfecciones sobre líneas celulares inmortalizadas (HEK293; PC-3; SW480) y cultivos primarios. Experimentos realizados por los Dres. Paco Olmo y Guillem Ramis. Finalmente, en el capítulo 7 se recogen todos los procedimientos experimentales descritos en la Tesis. Métodos de síntesis y caracterización espectroscópica de productos. Procedimientos de separación de los polímeros. Caracterización mediante métodos EGA, GPC y DOSY. Procedimientos experimentales de microscopía AFM, dispersión DLS y potencial zeta, valoraciones vía UV-Vis y RMN, etc. Métodos de evaluación biológica: cultivo, evaluación mediante imagen, procedimientos de transfección con pASQUA, experimentos de retardo de gel y otros.

[cat] La teràpia gènica persegueix tractar malalties i desordres d'origen genètic. Una extensió transcendent de la teràpia gènica és la correcció gènica que s'aconsegueix emprant sistemes de tipus CRISPR/Cas9. En essència, ambdues tècniques es basen en la inserció de material genètic exogen a nivell cel·lular amb la finalitat de modificar la corresponent expressió proteica. Tot i que el potencial de desenvolupament de les teràpies gèniques és enorme existeixen obstacles importants que impedeixen un ús clínic habitual d'aquestes teràpies. Entre aquests, són particularment importants els riscos associats a la bioseguretat i a la falta d'efectivitat dels tractaments. En l’àmbit experimental, la inserció cel·lular de qualsevol tipus d'ADN requereix la utilització de vectors de transfecció. En aquesta tasca s'empren vectors virals que posseeixen elevada efectivitat però introdueixen riscos biològics. Com a alternativa s'estan desenvolupant vectors de tipus químic que, en general, presenten un menor risc biològic però l'efectivitat del qual és limitada. Aquesta Tesi Doctoral, titulada “Síntesi i caracterització de poliaminoesquaramides: estudis d'agregació i activitat biològica”, sorgeix de l'experiència prèvia sobre el comportament d’esquaramides i γ-aminoesquaramides i descriu per primera vegada la síntesi de polímers de base esquaramida com a vectors de transfecció. S'anomena transfecció al transport de material genètic exogen, en forma de plasmid o altres eines, a l'interior de cèl·lules eucariotes. Es descriu també la seva aplicació per a la inserció efectiva de material genètic sobre una varietat d'organismes unicel·lulars incloent cèl·lules humanes, protistos i bacteris. La Tesi es divideix en vuit capítols, que s'han anat desenvolupant seguint un flux de treball temporal, ja que els objectius de cada capítol deriven dels resultats obtinguts en el capítol anterior. En els dos primers capítols s'introdueix al lector sobre les característiques estructurals de les esquaramides, la seva capacitat d'interacció amb altres molècules i les aplicacions que sorgeixen en diversos camps. En definitiva, es reconeix en el nucli "esquaramida" un component de petita mida, amb caràcter aromàtic i una elevada capacitat d'interacció via enllaços d’hidrogen, amb unes certes característiques peptidomimètiques i amb baixa toxicitat cel·lular. Un conjunt de propietats idònies per al desenvolupament de l'objectiu primordial de la Tesi que és el de desenvolupar un nou vector de transfecció químic que reuneixi efectivitat i baixa toxicitat cel·lular. En el capítol 3 es descriuen els experiments realitzats sobre un oligòmer cíclic de dues unitats esquaramida (MC2). Els experiments previs a la Tesi semblaven indicar que aquest compost podia presentar activitat transfectiva. Tot i que l'estudi recollit en aquesta Memòria ha descartat qualsevol tipus d'activitat en aquest sentit. El compost MC2, del qual s'ha aconseguit la seva estructura de raigs X, pot presentar diverses conformacions. En aquest capítol es descriu la síntesi d'una variant de MC2 soluble en dissolvents apolars. L'estudi realitzat, d’acord amb múltiples experiments UV-Vis i RMN a temperatura i concentració variables, ha permès descobrir fins a tres tipus d'agregació i s'ha demostrat la complexa interrelació que existeix entre els diferents estats agregats. El capítol 4 aprofundeix en la idea inicial, en el sentit que les oligoesquaramides cícliques podrien presentar activitat transfectiva. El capítol descriu la síntesi d’oligoesquaramides cícliques d'una a vuit unitats esquaramida (MC1-MC8). A les tècniques habituals, la caracterització de la sèrie incorpora anàlisi mitjançant cromatografia de permeació en gel (GPC) amb detecció mitjançant índex de refracció (RI), espectroscòpia UV-Vis i espectrometria de masses (MS). Els cromatogrames GPC proven la puresa dels oligòmers MC1 a MC4 però al mateix temps han permès descobrir que els macrocicles superiors (MC5 a MC8) contenen proporcions variables d'uns altres oligòmers i a més, especialment en MC7 i MC8, es detecta la formació d'un material desconegut d'elevat pes molecular. L'avaluació de l'activitat transfectiva de la sèrie indica una certa activitat transfectiva associada a MC7 i MC8. En cap cas s'observa toxicitat cel·lular ressenyable. En el capítol 5, es planteja directament que polímers de base esquaramida podrien ser responsables de la transfecció. En aquest capítol es descriuen diversos procediments per a la síntesi de polímers de tipus poliaminoesquaramida (pASQUA) i la seva separació mitjançant precipitació fraccionada o mitjançant filtració centrífuga fraccional. La caracterització espectroscòpica, l'anàlisi GPC de les diferents fraccions, les mesures d'espectroscòpia RMN de difusió (DOSY) i la corresponent avaluació biològica, ha permès descobrir que l'activitat transfectiva de les esquaramides s'origina en polímers de massa molecular > de 3 kDa, que contenen al voltant d'un centenar d'unitats γ-aminoesquaramides. Els polímers pASQUA són químicament estables (2 > pH > 8) i solubles en mitjans aquosos lleugerament àcids. El capítol 6 es troba en la interfase de la química i la biologia. En aquest capítol s'estudia la interacció pASQUA::ADN utilitzant plasmidis i altres àcids nucleics. Es descriuen imatges dels complexos obtingudes per microscòpia de forces atòmiques (AFM) combinades amb mesures de potencial zeta i diàmetre hidrodinàmic realitzades mitjançant dispersió dinàmica de llum (DLS). Tot això juntament amb els experiments de desplaçament d'indicadors fluorescents (FID) i sempre amb l'avaluació biològica ha demostrat l'elevada capacitat de transfecció dels polímers pASQUA. Alguns experiments de transfecció sobre organismes unicel·lulars realitzats amb èxit amb pASQUA inclouen: protistos unicel·lulars (Trypanosoma cruzi) formes epimastigot i amastigot. Monocercomonides (per als quals no existeix cap mètode efectiu de transfecció). Transformació extracel·lular de bacteris (Mycobacterium tuberculosis). Transformació intracel·lular de bacteris (Rickettsia canadensis i Orientia tsutsugamushi) en cèl·lules VERO. Transfeccions sobre línies cel·lulars immortalitzades (HEK293; PC-3; SW480) i cultius primaris. Experiments realitzats pels Drs. Paco Olmo i Guillem Ramis. Finalment, en el capítol 7 es recullen tots els procediments experimentals descrits en la Tesi. Mètodes de síntesis i caracterització espectroscòpica de productes. Procediments de separació dels polímers. Caracterització mitjançant mètodes EGA, GPC i DOSY. Procediments experimentals de microscòpia AFM, dispersió DLS i potencial zeta, valoracions via UV-Vis i RMN, etc. Mètodes d'avaluació biològica: cultiu, avaluació mitjançant imatge, procediments de transfecció amb pASQUA, experiments de retard de gel i altres.

[eng] Gene therapy aims to treat diseases and disorders of genetic origin. A major extension in gene therapy is gene edition that is achieved using CRISPR/Cas9-type systems. In essence, both techniques are based on the insertion of exogenous genetic material at the cellular level to modify the corresponding protein expression. Although the potential for the development of gene therapies is enormous, there are significant drawbacks to the regular clinical use of gene therapies. Particularly important among these are the risks associated with biosecurity and the lack of effectiveness of treatments. At the experimental level, the insertion of any type of DNA into cells requires the use of transfection vectors. Viral vectors are used for this purpose but, despite of their high effectiveness entail biological risks. As an alternative, chemical vectors with lower biological risk but whose effectiveness is limited. This Doctoral Thesis, entitled "Synthesis and characterization of polyaminosquaramides: aggregation and biological activity studies", is based on the previous experience on the behavior of squaramides and γ-aminosquaramides and describes for the first time the synthesis of squaramide-based polymers as transfection vectors. Transfection refers to the transport of exogenous genetic material, in the form of plasmid or other tools, into eukaryotic cells. It also describes its application for the effective insertion of genetic material on a variety of single-celled organisms including human cells, protists, and bacteria. The thesis is divided into eight chapters, which have been developed following a temporary workflow since the objectives of each chapter derive from the results obtained in the previous one. The first two chapters introduce the reader to the structural characteristics of squaramides, their ability to interact with other molecules, and the applications that arise in various fields. In short, the "squaramide" nucleus is recognized as a small component, with an aromatic character and a high interaction capacity via hydrogen bonds, with certain peptidomimetic characteristics and with low cell toxicity. A set of properties suitable for the development of the primary objective of the Thesis is to develop a new vector of chemical transfection with high effectiveness and low cell toxicity. Experiments on a two-unit squaramide cyclic oligomer (MC2) are described in Chapter 3. Results obtained before the Thesis suggested that this compound could have transfective activity. Although the study performed afterward and included in this Thesis has ruled out having any transfective activity. The MC2 compound, from which its X-ray structure has been achieved, can present several conformations. This chapter describes the synthesis of a variant of MC2 soluble in non-polar solvents. The study, based on multiple UV-Vis and NMR experiments at variable temperature and concentration, has allowed to discover up to three types of aggregation and has demonstrated the complex interrelation that exists between the different aggregated states. Chapter 4 enquires into the initial idea, that cyclic oligo-squaramides might possess transfection activity. The chapter describes the synthesis of macrocicles with one to eight squaramide units (MC1-MC8). To the usual techniques, the characterization of the series incorporates analysis by gel permeation chromatography (GPC) with detection by refractive index (RI), UV-Vis spectroscopy, and mass spectrometry (MS). GPC chromatograms proved the purity of MC1 to MC4 oligomers but at the same time have revealed that the upper macrocycles (MC5 to MC8) contain variable proportions of other oligomers. MC7 and MC8 samples reveal, the formation of an unknown material of high molecular weight. The evaluation of the transfection activity in the series indicates some transfection activity associated with MC7 and MC8. Any of these macrocicles showed remarkable cell toxicity. Chapter 5 directly states that squaramide-based polymers may be responsible for transfection. This chapter describes several procedures for the synthesis of polymers of the polyaminosquaramide type (pASQUA) and their separation by fractional precipitation or by centrifugal fractional filtration. Spectroscopic characterization, GPC analysis of individual fractions, diffusion NMR spectroscopy (DOSY) measurements, and corresponding biological assessment, has revealed that the transfection activity of squaramides originates in polymers of molecular mass > 3 kDa, containing about one hundred γ-aminosquaramide units. pASQUA polymers are chemically stable (2 > pH > 8) and soluble in slightly acidic aqueous media. Chapter 6 moves to the interface of chemistry and biology. This chapter studies pASQUA::DNA interaction using plasmids and other nucleic acids. We describe images of the polyplexes obtained by atomic force microscopy (AFM) combined with measurements of zeta potential and hydrodynamic diameter made by dynamic light scattering (DLS). All this together with the experiments of displacement of fluorescent indicators (FID) and always with the biological evaluation has shown the high capacity of transfection of the polymers pASQUA. Some transfection experiments on single-celled organisms successfully performed with pASQUA include single-celled protists (Trypanosoma cruzi) epimastigote and amastigote forms. Monocercomonides (for which no effective transfection method exists). Extracellular transformation of bacteria (Mycobacterium tuberculosis). Intracellular transformation of bacteria (Rickettsia canadensis and Orientia tsutsugamushi) into VERO cells. Transfections on cultured cell lines (HEK293; PC-3; SW480) and primary cultures. Experiments conducted by Ph.D. Paco Olmo and Guillem Ramis. Finally, chapter 7, contain all the experimental procedures used in the thesis, including synthetic methods and spectroscopic characterization of products, polymer purification procedures, characterization using EGA, GPC, and DOSY methods, experimental procedures for AFM microscopy, DLS dispersion, UV-Vis and NMR titration, etc. Additionally, the biological methods used for evaluation of the transfection effectivity: cell culture and image evaluation, transfection procedures with pASQUA, gel delay experiments, and others are also described.