Regulación farmacológica de las Map Quinasas MEK1/2 y ERK1/2 en la señalización de los receptores Gabbaa y NMDA: curso temporal de sueño inducido por agentes hipnóticos/anestésicos en cerebro de ratón

Abstract

[spa] Las proteína quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) se organizan en cascadas proteicas, formando rutas de señalización que permiten responder a una gran variedad de estímulos extracelulares. La vía de las MAPKs ERK1/2, participa en una gran diversidad de procesos fisiológicos entre los que se encuentran la proliferación, diferenciación y supervivencia celular, la modulación de la expresión génica y la formación de la memoria. La importancia de esta vía se ve reflejada en los distintos trastornos que se relacionan con su desregulación, como por ejemplo las llamadas RASopatías o diversos tipos de cáncer. En distintos estudios se ha observado que tratamientos con fármacos hipnóticos/anestésicos conllevan una reducción en los contenidos de la proteína p-ERK1/2, efecto que puede relacionarse con déficits en aprendizaje y memoria. En la presente Tesis doctoral se llevó a cabo un paradigma experimental de sueño inducido por fármacos hipnóticos/anestésicos en ratones in vivo. Se utilizaron diversos moduladores alostéricos positivos del receptor GABAA (midazolam, pentobarbital, etanol, hidrato de cloral e isoflurano) y un antagonista no competitivo del receptor NMDA (ketamina) para la inducción de un curso temporal de sueño (rango: 25-160 min), durante el cual se fueron sacrificando ratones a distintos tiempos. Los objetivos principales del estudio fueron evaluar cómo los distintos fármacos hipnóticos/anestésicos modulan la fosforilación secuencial de las quinasas MEK1/2 y ERK1/2, así como también estudiar el papel de las formas de la proteína multifuncional FADD y el ratio indicador de neuroplasticidad p-FADD/FADD en el modelo conductual propuesto. Todos los fármacos utilizados en este trabajo redujeron significativamente los niveles de activación de las MAPKs ERK1/2 (ratio entre la forma fosforilada y la forma total). Sorprendentemente, al evaluar el contenido de sus quinasas activadoras p-MEK1/2, se observó que estas se encuentran incrementadas, indicando la existencia de una disrupción entre la fosforilación secuencial de estas dos enzimas. La relevancia de estos resultados reside en el hecho de que las MAPKs ERK1/2 son los únicos sustratos conocidos de las quinasas MEK1/2 in vivo y la activación secuencial entre ellas, es aceptada como un conocido mecanismo de señalización celular. Debido al importante papel que tiene la vía de ERK1/2 en diversos procesos celulares y el amplio abanico de respuestas fisiológicas que esta vía es capaz de generar, presenta numerosos mecanismos para la especificidad de respuesta y además se encuentra estrechamente regulada. Así, se evaluaron algunos de los mecanismos potencialmente implicados en la disrupción observada, como por ejemplo algunas de las fosfatasas responsables de la desactivación de ERK1/2 y también la forma 6 inactivada de la proteína MEK1 (p-Thr286 MEK1). Se observó que en el sueño inducido por la benzodiazepina midazolam, los contenidos de la fosfatasa MKP-3 y de p-MEK1 estaban incrementados en la corteza cerebral de ratón. Aunque en este caso los resultados obtenidos podrían haber explicado parcialmente la reducción en la activación de ERK1/2, la compleja interacción con el fármaco flumazenilo indica que otros mecanismos distintos a los estudiados deben ser los principales responsables. En el caso del barbitúrico pentobarbital y del fármaco ketamina, los niveles de p-MEK1 y MKP-3 no se vieron alterados. Durante el curso temporal de sueño inducido por los distintos fármacos hipnóticos/anestésicos de interés, se observó que los contenidos de la proteína p-FADD en corteza cerebral de ratón se encontraban significativamente incrementados en todos los casos. Estos resultados, junto con la reducción o no alteración de la forma total de la proteína FADD, llevaron a un aumento muy significativo del ratio p-FADD/FADD, pudiendo indicar la existencia de neuroplasticidad durante el transcurso del sueño inducido por fármacos hipnóticos/anestésicos. Mediante el tratamiento con flumazenilo, un ligando neutro que se comporta como antagonista alostérico del receptor GABAA, se investigó la implicación de este receptor en los efectos observados durante el sueño inducido por midazolam y ketamina. La interacción farmacológica con flumazenilo, moduló la duración del sueño inducido por ambos fármacos, indicando la implicación del receptor GABAA en los sistemas moleculares que producen el sueño inducido por midazolam y ketamina. Por otro lado, la utilización de SL-327 (fármaco inhibidor de MEK1/2) para inducir una reducción de p-ERK1/2, resultó en el incremento de la duración del sueño inducido por el fármaco ketamina. Este resultado demuestra la implicación directa de la modulación de estas MAPKs en los mecanismos responsables del sueño inducido por este fármaco. La utilización del inhibidor metabólico SKF525-A, reveló la participación de diversas proteínas (p-MEK1/2, p-ERK1/2, p-FADD y p-PEA-15) en los procesos moleculares relacionados con el sueño inducido por pentobarbital, debido al aumento observado en el tiempo de sueño inducido por el barbitúrico y a la regulación paralela y persistente de las proteínas nombradas. Por otro lado, se estudiaron algunos marcadores de neuroplasticidad (PSD-95, NF-κB) y la proteína PEA-15 durante el curso temporal de sueño inducido. El contenido del marcador de plasticidad NF-κB se vio incrementado durante el sueño inducido por los fármacos midazolam, ketamina y pentobarbital. También se encontró un incremento significativo en el contenido de p-PEA-15 en el sueño inducido por pentobarbital y ketamina (en menor medida), en concordancia con estudios previos que lo habían observado durante el sueño 7 inducido por midazolam. Estos resultados indican que PEA-15 podría tener relación con los mecanismos moleculares adyacentes al sueño inducido por fármacos, como se ha observado para las proteínas FADD y ERK1/2, con las que PEA-15 puede interaccionar y modular algunas de sus acciones. En conclusión, los resultados obtenidos en la presente Tesis doctoral indican la importancia de la señalización de ERK1/2 y, en menor medida, de la proteína p-FADD en el sueño inducido por distintos fármacos de características muy diversas en cerebro de ratón. Además se ha descubierto una disrupción en la activación secuencial de las quinasas MEK1/2 y ERK1/2 durante el transcurso del sueño inducido por todos los fármacos hipnóticos/anestésicos utilizados. A su vez, todos los tratamientos indujeron un aumento en los niveles de p-FADD y en el ratio indicador de neuroplasticidad p-FADD/FADD. La reducción en los niveles de activación de ERK1/2 junto con el aumento del ratio p-FADD/FADD y de otros marcadores de neuroplasticidad, podrían relacionarse con algunos de los efectos adversos que presentan los fármacos hipnóticos/anestésicos, como la amnesia, tolerancia o déficits en aprendizaje y memoria.

[cat] Les proteïnes quinases activades per mitògens (MAPKs) s’organitzen en cascades proteiques, formant rutes de senyalització que permeten respondre a una gran diversitat d’estímuls extracel·lulars. La via de les MAPKs ERK1/2 participa en una gran diversitat de processos fisiològics entre els quals es troba la proliferació, diferenciació i supervivència cel·lular, la modulació de l’expressió gènica i la formació de la memòria. La importància d’aquesta via es veu reflectida en els distints trastorns que es relacionen amb la seva desregulació, com per exemple les RASopaties o diversos tipus de càncer. En distints estudis s’ha observat que els tractaments amb fàrmacs hipnòtics/anestèsics impliquen una reducció en els continguts de la proteïna p-ERK1/2, un efecte que es pot relacionar amb dèficits en l’aprenentatge i la memòria. En la present Tesi doctoral es va dur a terme un paradigma experimental de son induït per fàrmacs hipnòtics/anestèsics en ratolins in vivo. S’han utilitzat diversos moduladors al·lostèrics positius del receptor GABAA (midazolam, pentobarbital, etanol, hidrat de cloral i isoflurà) i un antagonista no competitiu del receptor NMDA (ketamina) per a induir un curs temporal de son (rang: 25-160 min), durant el qual es van anar sacrificant ratolins a diferents temps. Els objectius principals de l’estudi van ser l’avaluació de com els distints fàrmacs hipnòtics/anestèsics modulen la fosforilació seqüencial de les quinases MEK1/2 i ERK1/2, així com estudiar el paper de les formes de la proteïna multifuncional FADD i el quocient indicador de neuroplasticitat p-FADD/FADD en el model conductual proposat. Tots el fàrmacs utilitzats en aquest treball van reduir significativament els nivells d’activació de les MAPKs ERK1/2 (quocient entre la forma fosforilada i la forma total). Sorprenentment, quan es va avaluar el contingut de les seves quinases activadores p-MEK1/2, es va observar que aquestes es troben incrementades, indicant l’existència d’una disrupció entre la fosforilació seqüencial d’aquests dos enzims. La rellevància d’aquests resultats resideix en el fet que les MAPKs ERK1/2 són els únics substrats coneguts de les quinases MEK1/2 in vivo i l’activació seqüencial entre elles, és acceptada com un conegut mecanisme de senyalització cel·lular. A causa de l’important paper que té la via de ERK1/2 en diversos processos cel·lulars i l’ampli ventall de respostes fisiològiques que aquesta via és capaç de generar, presenta nombrosos mecanismes per a l’especificitat de resposta i, a més, es troba estretament regulada. Així, es van avaluar alguns dels mecanismes potencialment implicats en la disrupció observada, com per exemple algunes de les fosfatases responsables de la desactivació de ERK1/2 i també la forma inactivada de la proteïna MEK1 (p-Thr286 MEK1). Es va observar que en el son induït per la benzodiazepina midazolam, els continguts de la 10 fosfatasa MKP-3 i de la p-MEK1 estaven incrementats en el còrtex cerebral de ratolí. Encara que en aquest cas els resultats obtinguts podrien haver explicat parcialment la reducció en l’activació de ERK1/2, la complexa interacció amb el fàrmac flumazenil indica que altres mecanismes diferents als estudiats deuen ser els principals responsables. En el cas del barbitúric pentobarbital i del fàrmac ketamina, els nivells de p-MEK1 i MKP-3 no es van trobar alterats. Durant el curs temporal de son induït pels distints fàrmacs hipnòtics/anestèsics d’interès, es va observar que els continguts de la proteïna p-FADD en el còrtex cerebral de ratolí es trobaven significativament incrementats en tots els casos. Aquests resultats, juntament amb la reducció o no alteració de la forma total de la proteïna FADD, condueixen a un augment molt significatiu de la ràtio p-FADD/FADD podent indicar l’existència de neuroplasticitat durant el transcurs del son induït per fàrmacs hipnòtics/anestèsics. Mitjançant el tractament amb flumazenil, un lligant neutre que es comporta com antagonista al·lostèric del receptor GABAA, es va investigar la implicació d’aquest receptor en els efectes observats durant el son induït per midazolam i per ketamina. La interacció farmacològica amb flumazenil, va modular la duració del son induït per ambdós fàrmacs, indicant la implicació del receptor GABAA en els sistemes moleculars que produeixen el somni induït per midazolam i ketamina. Per altra banda, la utilització de SL-327 (fàrmac inhibidor de MEK1/2) per a induir una reducció de p-ERK1/2, va resultar en l’increment de la duració del son induït pel fàrmac ketamina. Aquest resultat demostra la implicació directa de la modulació d’aquestes MAPKs en els mecanismes responsables del son induït per aquest fàrmac. La utilització de l’inhibidor metabòlic SKF525-A, va revelar la participació de diverses proteïnes (p-MEK1/2, p-ERK1/2, p-FADD i p-PEA-15) en els processos moleculars relacionats amb el son induït per pentobarbital, a causa de l’augment observat en el temps de son induït pel barbitúric i a la regulació paral·lela i persistent de les proteïnes anomenades. Per una altra banda, es van estudiar alguns marcadors de neuroplasticitat (PSD-95, NF-κB) i la proteïna PEA-15 durant el curs temporal de son induït. El contingut del marcador de plasticitat NF-κB es va veure incrementat durant el son induït pels fàrmacs midazolam, ketamina i pentobarbital. També es va trobar un increment significatiu en el contingut de p-PEA-15 en el son induït per pentobarbital i ketamina (en menor mesura), en concordança amb estudis previs que ho havien observat durant el son induït per midazolam. Aquests resultats indiquen que PEA-15 podria tenir relació amb els mecanismes moleculars 11 adjacents al son induït per fàrmacs, com s’ha observat en el cas de les proteïnes FADD i ERK1/2, amb les que PEA-15 pot interaccionar i modular algunes de les seves accions. En conclusió, els resultats obtinguts en la present Tesi doctoral indiquen la importància de la senyalització de ERK1/2 i, en menor mesura, de la proteïna p-FADD en el son induït per distints fàrmacs de característiques molt diverses en el cervell de ratolí. A més, s’ha descobert una disrupció en l’activació seqüencial de les quinases MEK1/2 i ERK1/2 durant el transcurs del son induït per tots els fàrmacs hipnòtics/anestèsics utilitzats. A la vegada, tots els tractaments van induir un augment en els nivells de p-FADD i en el quocient indicador de neuroplasticitat p-FADD/FADD. La reducció en els nivells d’activació de ERK1/2 juntament amb l’augment del quocient p-FADD/FADD i d’altres marcadors de neuroplasticitat, podrien relacionar-se amb alguns dels efectes adversos que presenten els fàrmacs hipnòtics/anestèsics, com l’amnèsia, la tolerància o dèficits en l’aprenentatge i la memòria.

[eng] The mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are organized in protein cascades forming signaling pathways that allow them to respond to a wide variety of extracellular stimuli. The ERK1/2 MAPK pathway takes part in a large diversity of physiological processes, including cell proliferation, differentiation and survival, modulation of gene expression and memory formation. The importance of this pathway is reflected in the different disorders related to its deregulation, such as the so-called RASopathies or different types of cancer. Various studies have shown that treatments with hypnotic/anesthetic drugs lead to downregulation of p-ERK1/2 content, an effect that can be related to learning and memory deficits. In the present PhD work, an experimental paradigm of sleep induced by hypnotic/anesthetic drugs was carried out in mice in vivo. Various positive allosteric modulators of the GABAA receptor (midazolam, pentobarbital, ethanol, chloral hydrate and isoflurane) and a non-competitive antagonist of the NMDA receptor (ketamine) were used to induce sleep (sleeping time course range: 25-160 min), during which mice were sacrificed at different times. The main objectives of the study were to evaluate how the different hypnotic/anesthetic drugs modulate the sequential phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2 kinases, as well as to study the role of multifunctional FADD forms and the neuroplastic p-FADD/FADD ratio, in the proposed behavioral model. All the drugs used in this study significantly reduced the activation of ERK1/2 MAPKs (ratio of phosphorylated enzyme/total enzyme). Surprisingly, the content of their activating kinases p-MEK1/2 was found increased, indicating the existence of a disruption between the sequential phosphorylation of these two kinases. The relevance of these results relies in the fact that ERK1/2 MAPKs are the only known substrates of the MEK1/2 kinases in vivo and the sequential activation between them is accepted as a well-known cellular signaling mechanism. Due to the important role of the ERK1/2 pathway in various cellular processes and the wide range of physiological responses that this pathway is able to generate, it is tightly regulated and there are numerous mechanisms for its response specificity. In this context, some of the potentially involved mechanisms in the observed disruption were assessed, such as some of the phosphatases responsible for ERK1/2 deactivation and one inactivated form of the MEK1 protein (p-Thr286 MEK1). The contents of phosphatase MKP-3 and p-MEK1 were found increased in mouse cerebral cortex during midazolam-induced sleep. Even though these results could partially explain the reduction in the activation of ERK1/2, the complex interaction observed with flumazenil showed that distinct mechanisms other than those studied might be the main responsible ones. In the case of the barbiturate pentobarbital and ketamine the contents of p-MEK1 and MKP-3 were unaltered. 14 During the time course of sleep induced by the different hypnotic/anesthetic drugs of interest, the contents of p-FADD protein in mouse cerebral cortex were significantly increased in all cases. These results, along with the reduction or non-alteration of the total FADD form, led to a very significant increase in the p-FADD/FADD ratio, which could indicate the existence of neuroplasticity mechanisms taking place during the course of hypnotic/anesthetic-induced sleep. The involvement of GABAA receptor in the effects observed during midazolam- and ketamine-induced sleep was assessed with flumazenil, a neutral ligand that behaves as an allosteric antagonist of this receptor. The pharmacological interaction with flumazenil modulated the duration of sleep induced by both drugs, indicating the involvement of GABAA receptor in the molecular systems associated with midazolam-and ketamine-induced sleep. On the other hand, the use of SL-327 (a MEK1/2 inhibitor) to induce a downregulation of p-ERK1/2 content resulted in an increase in the duration of ketamine-induced sleep. This result proves the direct involvement of the modulation of these MAPKs in the mechanisms responsible for sleep induced by this drug. The use of the metabolic inhibitor SKF525-A revealed the implication of several proteins (p-MEK1/2, p-ERK1/2, p-FADD and p-PEA-15) in the molecular processes related to pentobarbital-induced sleep, due to the noted increase in the barbiturate-induced sleep duration and the parallel and persistent regulation of the mentioned proteins. On the other hand, some neuroplasticity markers (PSD-95, NF-κB) and protein PEA-15 were studied throughout the course of drug-induced sleep. The neuroplastic marker NF-κB was increased during midazolam-, ketamine- and pentobarbital-induced sleep. Also, a significant increase in the content of p-PEA-15 was found in pentobarbital and ketamine (in a small extent) induced sleep, in line with previous studies that observed it during midazolam-induced sleep. These results indicate that PEA-15 could be involved in the molecular mechanisms adjacent to drug-induced sleep, as has been observed for FADD and ERK1/2, with which PEA-15 can interact and modulate some of its actions. In conclusion, the results obtained in this PhD work indicate the importance of the brain signaling of ERK1/2 and, to a lesser extent, p-FADD in the sleep induced in mice by different drugs of very distinct characteristics. In addition, a disruption in the sequential activation of MEK1/2 and ERK1/2 kinases was discovered during the time course of sleep induced by all the hypnotic/anesthetic drugs ascertained. In turn, all treatments upregulated p-FADD content and the neuroplastic p-FADD/FADD ratio. The reduction in the activation levels of ERK1/2 together with the increase in p-FADD/FADD ratio and other neuroplastic markers

could be related to some of the adverse effects produced by hypnotic/anesthetic drugs, such as amnesia, tolerance or deficits in learning and memory.