Use of the lipid fingerprint for the identification of new biomarkers and therapeutic targets in colon cancer

Abstract

[eng] The study of membrane lipids in the biomedical field is currently changing. Solid advances in lipid analysis have facilitated the access to detailed descriptions of many different lipidomes, while the irruption of imaging mass spectrometry (IMS) techniques providing the bidimensional distribution of each lipid species across a tissue section has undoubtedly demonstrated how specific this distribution is. The possibility of building complex profiles based on the combination of different molecular species, all measured at once, offers a wide variety of potential biomarkers for diagnosis. Furthermore, because of their tight participation in biological processes, membrane lipids could also be used to monitor the progression or treatment of a disease. The lipidome has proven to be highly sensitive not only to cell type but also to any biological process including differentiation, malignization, and death. In this sense, our previous studies analyzing the changes in the lipid signature along the colon epithelium demonstrate that there is a strict regulation at the molecular species level, concomitant to the colonocyte differentiation process and that this regulation is clearly altered in the malignant tissue. Taking this into account, the first aim of the thesis was to delve into the mechanisms regulating membrane lipid metabolism during colonocyte differentiation and malignization by following a multiple technique approach. The latter included cell sorting flow cytometry by FACS, microarray gene expression, and IMS. The results included herein highlight that any change in lipid composition, even if this implies a relatively simple phenotypic change, may involve a large number of regulatory agents, and some of them could become regulatory targets. The second aim of the thesis was to apply IMS to the study of the lipid fingerprint to identify the most subtle alterations in the lipidome so that we could contribute to define and refine the stratification protocols for pathological conditions. In particular, human samples of patients with colon cancer, inflammatory bowel disease (IBD), and glioblastoma multiforme (GMB) were analyzed by IMS. The analysis of healthy human and CRC samples by IMS demonstrated the capacity of these techniques to detect molecular alterations associated with the lipid fingerprint, identifying the [Na+]/[K+] lipid adducts ratio as a potential pathological biomarker of tumorigenesis. Alterations in this ratio lead to the identification of a potential CRC pharmacological target, associating its expression with patient survival significance, with CRC CMS heterogeneity, and with a notable decrease in CRC cell lines proliferation under in vitro inhibition. Next, the analysis of IBD biopsies, demonstrated that the IBD epithelium was able to maintain some of the gradients in membrane lipids. However, changes in the content of AA-containing species allowed the discrimination between healthy and IBD mucosa. Finally, the novel distribution of a sphingomyelin species in both healthy colon and IBD crypts was detected, with a potential implication in colonocyte differentiation. IMS was also applied to investigate the impact of GMB and of temozolomide the standard care treatment for GMB on brain lipidome. Interestingly, more changes were detected in the healthy brain than in GBM tissue. The study of the GBM main membrane lipid alteration, and gene expression profiles, identify an interesting role of polyunsaturated fatty acids in different molecular subtypes of GBM, offering a solid base to further explore new pharmacological targets. Altogether, the results described the complexity of the regulation of specific lipid phenotypes and highlighted the sensitivity of the lipid fingerprint to different cellular fractions, proliferative states, and pathological conditions. Furthermore, these results emphasize the versatility of the MALDI-IMS in the study of membrane lipid composition and the detection of associated molecular alterations in specific cellular processes.

[cat] Actualment l'estudi dels lípids de membrana en el camp de la biomedicina està canviant gràcies als sòlids avenços en l'anàlisi de lípids que han facilitat la descripció detallada de nombrosos i diferents lipidomes. La irrupció de les tècniques d'imatge per espectrometria de masses (IMS), que proporcionen la distribució bidimensional de centenars d'espècies lipídiques en una única secció de teixit, han permès demostrar sense cap dubte l’especificitat d’aquesta distribució. La possibilitat de establir perfils complexos basats en la combinació de les diferents espècies moleculars detectades, ofereix l’oportunitat d’identificar una àmplia varietat de potencials biomarcadors de diagnòstic. A més a més, l'estreta participació dels lípids de membrana en els processos biològics també podria usar-se per controlar la progressió d'una malaltia o la resposta al tractament. El lipidoma ha demostrat ser molt sensible no només al tipus cel·lular sinó també a processos biològics, incloent-hi la diferenciació, la malignització i la mort cel·lular. En aquest sentit, els nostres estudis previs analitzant els canvis en la empremta lipídica al llarg de l'epiteli del còlon, demostren que hi ha una estricta regulació a nivell d'espècies moleculars, concomitant al procés de diferenciació de colonocits i l'alteració de la regulació en el teixit tumoral. Tenint en compte això, el primer objectiu de la tesi va ser aprofundir en els mecanismes que regulen el metabolisme dels lípids de membrana durant la diferenciació i malignització dels colonocits. Per a això es va realitzar un enfocament amb múltiples tècniques que inclouen: la classificació de cèl·lules activades per fluorescència i citometria de flux, anàlisi del transcriptoma mitjançant microarrays d'expressió gènica i anàlisi del lipidome per IMS en mostres de pacients de càncer colorectal (CCR). Els resultats inclosos en aquesta tesi, destaquen que els canvis en la composició de lípids, fins i tot si aquests impliquen un canvi fenotípic relativament simple, involucren un gran nombre d'agents reguladors, podent ser algun d'ells una potencial diana reguladora. El segon objectiu de la tesi va ser aplicar les tècniques de IMS a l'estudi de la empremta lipídica per identificar alteracions subtils en el lipidoma per tal de contribuir a definir i afinar els protocols d'estratificació en condicions patològiques. En particular, es varen analitzar mostres de pacients amb CCR, malaltia inflamatòria intestinal (MII) i glioblastoma multiforme (GBM). L'anàlisi comparativa de mostres sanes i de CCR va demostrar la capacitat de les tècniques de IMS per detectar alteracions moleculars associades a la empremta lipídica. Així doncs, es va identificar la relació dels adductes lipídics de [Na+] i [K+] com un potencial biomarcador patològic de tumorigènesi. Les alteracions en aquesta ràtio conduïren a la identificació d'una possible diana farmacològica de CCR: la subunitat reguladora beta 2 de canal de potassi depenent de voltatge. L’expressió d’aquest canal està fortament associada amb la supervivència del pacient, amb l'heterogeneïtat molecular dels tumors i una notable reducció de la proliferació de les cèl·lules tumorals en estudis in vitro de CCR. A continuació, l'anàlisi de biòpsies de MII va demostrar que l'epiteli de inflamat era capaç de mantenir alguns dels gradients en els lípids de la membrana. Els canvis en el contingut de les espècies que contenen àcid araquidònic van permetre la discriminació entre la mucosa sana i la de MII. A més a més, es va detectar la distribució gradual d'una espècie d'esfingomielina tant en el còlon sa com en les criptes de MII, amb una possible implicació en la diferenciació de colonocits. Finalment, també es va aplicar IMS per investigar l'impacte de la temozolomida, tractament de referència del GMB, sobre el lipidoma cerebral. Curiosament, es van detectar més canvis en el cervell sa que en el teixit tumoral. L'estudi de l'alteració de lípids de la membrana ocasionats per GBM i els perfils d'expressió gènica varen permetre establir un paper interessant dels àcids grassos poliinsaturats en diferents subtipus moleculars de GBM, oferint una base sòlida per explorar més a fons noves dianes farmacològiques. En conjunt, els resultats descriuen la complexitat de la regulació de fenotips lipídics específics i destaquen la sensibilitat de l’empremta lipídica en diferents fraccions cel·lulars, estats proliferatius i condicions fisiopatològiques. A més, aquests resultats emfatitzen la versatilitat del MALDI-IMS en l'estudi de la composició de lípids de membrana i la detecció d'alteracions moleculars associades a processos cel·lulars específics.

[spa] Actualmente el estudio de los lípidos de membrana en el campo de la biomedicina está cambiando gracias a los sólidos adelantos en las técnicas analíticas, que han facilitado la descripción detallada de numerosos y diferentes lipidomas. La irrupción de las técnicas de imagen por espectrometría de masas (IMS), que proporcionan la distribución bidimensional de centenares de especies lipídicas en una única sección de tejido, han permitido demostrar sin lugar a duda la especificidad de esta distribución. La posibilidad de establecer perfiles complejos, basados en la combinación de las diferentes especies moleculares detectadas, ofrece la oportunidad de identificar una amplia variedad de potenciales biomarcadores de diagnóstico. Además, la estrecha participación de los lípidos de membrana en los procesos biológicos también podría usarse para controlar la progresión de una enfermedad o la respuesta al tratamiento. El lipidoma ha demostrado ser muy sensible no solo al tipo celular sino también a procesos biológicos, incluyendo la diferenciación, la malignización y la muerte celular. En este sentido, nuestros estudios previos en los que se analizron los cambios en la huella lipídica a lo largo del epitelio del colon, demuestran que hay una estricta regulación a nivel de especies moleculares, concomitante al proceso de diferenciación de colonocitos y la alteración de la regulación en el tejido tumoral. Teniendo en cuenta esto, el primer objetivo de la tesis fue profundizar en los mecanismos que regulan el metabolismo de los lípidos de membrana durante la diferenciación y malignización de los colonocitos. Para ello se realizó un enfoque con múltiplos técnicas que incluyen: clasificación de células activadas por fluorescencia y citometría de flujo, análisis del transcriptoma mediante microarrays de expresión génica y análisis del lipidoma por IMS en muestras de pacientes de cáncer colorrectal (CCR). Los resultados incluidos en esta tesis destacan que los cambios en la composición de lípidos, incluso si estos implican un cambio fenotípico relativamente simple, involucran un gran número de agentes reguladores, pudiendo ser alguno de ellos una potencial diana reguladora. El segundo objetivo de la tesis fue aplicar las técnicas de IMS al estudio de la huella lipídica para identificar alteraciones sutiles en el lipidoma para contribuir a definir y afinar los protocolos de estratificación en condiciones patológicas. En particular, se analizaron muestras de pacientes con CCR, enfermedad inflamatoria intestinal (MII) y glioblastoma multiforme (GBM). El análisis comparativo de muestras sanas y de CCR demostró la capacidad de las técnicas de IMS para detectar alteraciones moleculares asociadas a la huella lipídica. Así pues, se identificó la relación de los aductos lipídicos de [Na+] y [K+] como un potencial biomarcador patológico de tumorigénesis. Las alteraciones en esta ratio condujeron a la identificación de un posible objetivo farmacológico del CCR: la subunidad reguladora beta 2 de canal de potasio dependiente de voltaje. La expresión de este canal está fuertemente asociada con la supervivencia del paciente, la heterogeneidad molecular del tumor y la reducción notable de la proliferación tumoral en estudios in vitro de CCR. A continuación, el análisis de biopsias de MII demostró que el epitelio de inflamado era capaz de mantener algunos de los gradientes en los lípidos de la membrana. Los cambios en el contenido de las especies que contienen ácido araquidónico permitieron la discriminación entre la mucosa sana y la de MII. Además, se detectó la distribución gradual de una especie de esfingomielina tanto en el colon sano como en las criptas de MII, con una posible implicación en la diferenciación de colonocitos. Finalmente, también se aplicó IMS para investigar el impacto de la temozolomida, tratamiento de referencia del GMB, sobre el lipidoma cerebral. Curiosamente, se detectaron más cambios en el cerebro sano que en el tejido tumoral. El estudio de la alteración de lípidos de la membrana ocasionados por GBM y los perfiles de expresión génica permitieron establecer un papel interesante de los ácidos grasos poliinsaturados en diferentes subtipos moleculares de GBM, ofreciendo una base sólida para explorar más a fondo nuevas dianas farmacológicas. En conjunto, los resultados describen la complejidad de la regulación de fenotipos lipídicos específicos y destacan la sensibilidad de la huella lipídica en diferentes fracciones celulares, estados proliferativos y condiciones fisiopatológicas. Además, estos resultados enfatizan la versatilidad del MALDI-IMS en el estudio de la composición de lípidos de membrana y la detección de alteraciones moleculares asociadas a procesos celulares específicos.