Epidemiologia molecular y mecanismos de resistencia en Pseudomonas aeruginosa: impacto de los clones de alto riesgo y análisis del resistoma a través de la secuenciación masiva

Abstract

[cat] P. aeruginosa és intrínsecament resistent a molts antimicrobians, podent generar majors nivells de resistència mitjançant l’adquisició de mutacions i de determinants de resistència per transferència horitzontal, com per exemple b-lactamases. Per això, tot i que encara es desconeixen els mecanismes de resistència a aquests tractaments, la combinació d’antimicrobians clàssics amb composts que incrementen la sensibilitat bacteriana constitueix una valuosa eina terapèutica en adició als, escassos, nous antibiòtics com el ceftolozano, que pareix ser estable contra els mecanismes de resistència dirigits per mutació més comuns, i que determinaria una passa enrere en la lluita contra la resistència a b-lactàmics. P. aeruginosa presenta una estructura poblacional no clònica, amb la majoria d’aïllats representats per un únic genotip i alguns clons particularment comuns entre els aïllats multiresistents, àmpliament disseminats a nivell mundial, els quals s’han anomenat clons d’alt risc (HRC – High Risk Clones), que presenten combinacions de diferents mecanismes de resistència que expliquen el seu gran èxit. Entre els principals clons HRC internacionals presents a Espanya, trobem el clon ST175, del que encara hi ha escassa informació i del que es desconeixen els mecanismes de resistència que han propiciat el seu èxit. Per tot això, els objectius d’aquesta tesi son analitzar la prevalència i impacte dels mecanismes de resistència més comuns a P. aeruginosa causant de bacterièmies, així com la seva potencial associació amb perfils de multiresistència, realitzant una anàlisi genètica detallada dels marcadors epidemiològics i de resistència de P. aeruginosa multiresistents causants d’infeccions a diferents hospitals espanyols, aplicant tècniques de seqüenciació massiva a l’anàlisi de la filogènia i l’estudi del resistoma del clon d’alt risc ST175. Un altre objectiu important es desxifrar les trajectòries evolutives que condueixen a la resistència d’alt nivell a diferents antipseudomònics, incloent l’efecte sobre la virulència i el cost biològic, també baix l’impacte del fenotip hipermutador, a l’igual que realitzar una anàlisi comparativa de les dinàmiques i els mecanismes del desenvolupament de resistència al ceftolozano-tazobactam en comparació amb altres antipseudomònics clàssics A partir de l’estudi multicèntric, amb més de 600 aïllats productors de bacterièmies, en el que participaren 10 hospitals espanyols, s’observà que la hiperexpressió d’ampC era el mecanisme més prevalent, seguida per la hiperexpressió de bombes d’expulsió mexXY-oprM i mexAB-oprM. S’observà a més, que el 1% del total d’aïllats, els quals representaven el 4% dels aïllats resistents a imipenem, presentaven carbapenemasses, cosa que significà un increment de 10 vegades respecte del percentatge reflexat a un estudi multicèntric realitzat a Espanya 5 anys abans, augment que s’ha mantingut arribant-se a documentar prevalències de producció de carbapenemasses del 21% de les soques multiresistents (MDR) en estudis recents. Així, la presència de soques multiresistents, que redueixen les opcions de tractament i augmenten per tant el risc d’una teràpia inadequada i entre les quals es troben clons d’alt risc com el ST175, posa de manifest la necessitat de conèixer la seva possible associació amb un perfil de resistència i/o virulència específic, la qual cosa podria tenir un gran impacte en el desenllaç d’una infecció per P. aeruginosa. Mitjançant una anàlisi detallada, que inclogué l’ús de tècniques de seqüenciació de genoma complet, determinàrem els marcadors genètics de la resistència antibiòtica dels aïllats del seqüenciotip ST175. Tots els aïllats, excepte aquell sensible a ceftazidima, mostraren hiperexpressió d’ampC causada per una nova mutació a AmpR (G154R) i la resistència a carbapenems correlacionà bé amb la inactivació de oprD. Resum de la tesi 7 Emergiren mutacions a ftsI (PBP3) de forma independent a tres aïllats del ST175, suggerint que la PBP3 es troba sota pressió mutacional, i que l’aïllat que mostrà una substitució a PBP1b, localitzada a un residu molt conservat, presenta major resistència en general a cefalosporines, penicil·lines i monobactàmics. A més, tots els aïllats mostraren la mutació a MexZ (G195E) responsable de la hiperproducció de MexXY i, de forma addicional, alguns aïllats mostraren una substitució a mexX que pareix afectar al perfil de sustrats. A més, un dels aïllats mostrà una mutació inactivant a mexA associada a la hipersensibilitat a la majoria dels b-lactàmics. Tots els aïllats espanyols mostraren una major resistència a quinolones relacionada amb la presència d’una mutació (D87N) addicional a les mutacions clàssiques a GyrA (T83I). A més, tots els aïllats presentaren un integró de classe 1 portador del gen aadB responsable de la resistència a gentamicina i tobramicina, i sensibilitat a amikacina i ,exceptuant els aïllats procedents de Cantabria, tots els aïllats espanyols presentaren una mutació a GlpT (L211P) relacionada amb la resistència a fosfomicina. Amb la finalitat de desxifrar les trajectòries evolutives que condueixen a una resistència d’alt nivell a agents antipseudomònics de diferents classes, tant clàssics com nous composts tals el ceftolozano, emprarem l’anàlisi de la seqüenciació de genomes complets en mutants seleccionats després de l’exposició seqüencial a concentracions cada vegada majors d’antibiòtics durant 7 dies. Els mutants seleccionats per exposició a ciprofloxacino mostraren mutacions a les Regions Determinants de Resistència a Quinolones (QRDR) i hiperexpressaren bombes d’expulsió. És destacable que, a més de les mutacions clàssiques a GyrA i ParC, es va trobar una substitució no descrita a GyrA (E153K). El desenvolupament de resistència d’alt nivell a ceftazidime ocorregué fàcilment a la soca salvatge PAO1, essent inclús més ràpida a la soca hipermutadora PAOMS, mentre que va ocórrer de forma molt més lenta i assolint nivells menors després de 7 dies d’exposició, en el cas dels derivats de PAOAC (mutant deficient en ampC) i PAOAG (mutant deficient en ampG), ambdós incapaços de la producció, o inducció, de la cefalosporinassa cromosòmica AmpC. Contràriament, el desenvolupament de resistència va ser més lent pel ceftolozano/tazobactam, arribant sols a 8xCMI després dels 7 dies d’exposició. El primer pas del desenvolupament de la resistència a ceftolozano/tazobactam fou molt limitat, inclús per la soca hipermutadora, amb concentracions que assoliren sols 1xCMI després del primer dia. Els nivells de resistència dels mutants derivats de PAO1 i PAOMS foren resultat de la hiperexpressió de la cefalosporinassa cromosòmica AmpC, deguda a mutacions en els enzims de la via de reciclatge del pèptidglic DacB (PBP4), AmpD i/o AmpR. En canvi, com era d’esperar, no es trobaren mutacions en gens involucrats en la regulació d’ampC als derivats de PAOAC ni de PAOAG, la qual cosa revelà un repertori alternatiu de mutacions de resistència. S’observaren grans delecions de gens cromosòmics, junt amb mutacions que condueixen a la modificació de dianes dels b- lactàmics i/o a la hiperproducció o modificació estructural de la bomba d’expulsió MexAB-OprM, com a primer pas del desenvolupament de la resistència a b-lactàmics independent de la producció de b-lactamasses. Fou particularment interessant la detecció de mutacions a la PBP3, que també es documentaren en la selecció de mutants per exposició in vitro a meropenem. Tots els mutants seleccionats després de l’exposició a meropenem mostraren mutacions inactivants d’oprD, a més de mutacions a mexR o nalD, resultants en la hiperproducció de MexAB-OprM i sensibilitat reduïda a b-lactàmics i quinolones. Així Resum de la tesi doncs, l’exposició a meropenem seleccionà perfils de multiresistència i els resultats indicaren que la PBP3 és una, inesperada, diana principal pel desenvolupament de resistència a meropenem. Els mutants de PAO1 seleccionats per exposició a ceftolozano/tazobactam assoliren solament resistència moderada després de 7 dies d’exposició i, tot i que mostraren un petit nombre de mutacions, es va revelar un gran nombre de gens amb expressió modificada, no obstant cap de les mutacions o canvis d’expressió estaven directament relacionats amb els mecanismes de resistència clàssics suggerint que la resistència moderada a ceftolozano/tazobactam a PAO1 resulta de mutacions no específiques amb efectes pleiotròpics globals i un important cost biològic. Els mutants de PAOMS amb resistència d’alt nivell a ceftolozano/tazobactam sempre van incloure la hiperproducció d’AmpC, i presentaren d’una a quatre mutacions a residus conservats d’AmpC, que incrementen les CMIs de ceftolozano/tazobactam i ceftazidima, però les redueixen per piperacilina/tazobactam i imipenem. En general, l’impacte a l’eficiència biològica fou significativament menor per ceftazidima que per ciprofloxacino i meropenem, i molt menor als mutants de PAOMS que als mutants de PAO1. El treball presentat suposa un gran avanç en el coneixement dels marcadors genètics de la resistència dels aïllats del clon ST175 de P. aeruginosa, que podria resultar molt útil pel desenvolupament d’estratègies per a la detecció d’infeccions produïdes per aquest clon, així com també a les trajectòries evolutives del desenvolupament de resistència de P. aeruginosa tant a nous composts antipseudomònics o combinacions, la qual cosa pot ser d’utilitat a l’hora de dissenyar estratègies pel tractament de les infeccions per P. aeruginosa.

[spa] P. aeruginosa es intrínsecamente resistente a muchos antimicrobianos, pudiendo generar mayores niveles de resistencia debido a la adquisición de mutaciones y de determinantes de resistencia por transferencia horizontal, como por ejemplo b- lactamasas. Por ello, y aunque aún se desconocen los mecanismos de resistencia a estos tratamientos, la combinación de antimicrobianos clásicos con compuestos que incrementen la sensibilidad bacteriana constituye una valiosa herramienta terapéutica en adición a los, escasos, nuevos antibióticos como el ceftolozano, que parece ser estable contra los mecanismos de resistencia dirigidos por mutación más comunes y que determinarían un paso atrás en la lucha contra la resistencia a b-lactámicos. P. aeruginosa presenta una estructura poblacional no clónica, con la mayoría de aislados representados por un único genotipo, y con algunos clones particularmente comunes entre los aislados multirresistentes, ampliamente diseminados a nivel mundial, los cuales han sido llamados clones de alto riesgo (HRC – High Risk Clones), que presentan combinaciones de diferentes mecanismos de resistencia que explican su gran éxito. Entre los principales clones HRC internacionales presentes en España, encontramos el clon ST175, del que aún hay escasa información y del que se desconocen los mecanismos de resistencia que han propiciado su éxito. Por todo ello, los objetivos de esta tesis son analizar la prevalencia e impacto de los mecanismos de resistencia más comunes de P. aeruginosa causante de bacteriemia, así como su potencial asociación con perfiles de multirresistencia, realizando un análisis genético detallado de los marcadores epidemiológicos y de resistencia de P. aeruginosa multirresistentes causantes de infecciones en diferentes hospitales Españoles, aplicando técnicas de secuenciación masiva al análisis de la filogenia y el estudio del resistoma de los clones de alto riesgo ST175. Otro objetivo importante es descifrar las trayectorias evolutivas que conducen a la resistencia de alto nivel a diferentes antipseudomónicos, incluyendo el efecto sobre la virulencia y el coste biológico también bajo el impacto del fenotipo hipermutador, al igual que realizar un análisis comparativo de las dinámicas y los mecanismos del desarrollo de resistencia al ceftolozano-tazobactam en comparación con antipseudomónicos clásicos. A partir del estudio multicéntrico, con más de 600 aislados productores de bacteriemias, en el que participaron 10 hospitales españoles, se observó que la hiperepresión de ampC era mecanismo más prevalente, seguido de la hiperexpresión de bombas de expulsión mexXY-oprM y mexAB-oprM. Se observó además que el 1% del total de aislados, que representaba el 4% de los aislados resistentes a imipenem, presentaban carbapenemasas, lo que significó un incremento de 10 veces respecto del porcentaje reflejado en un estudio multicéntrico realizado en España 5 años antes, aumento que se ha mantenido llegandose a documentar prevalencias de producción de carbapenemasas del 21% de las cepas multirresistentes (MDR) en estudios recientes. Así pues la presencia de cepas multirresistentes, que reducen las opciones de tratamiento y aumentan por tanto el riesgo de una terapia inadecuada, entre las cuales se encuentran clones de alto riesgo como el ST175, pone de manifiesto la necesidad de conocer su posible asociación con un perfil de resistencia y/o virulencia específicos, lo cual podría tener un gran impacto en el desenlace de una infección por P. aeruginosa. Mediante un detallado análisis, que incluyó la utilización de técnicas de secuenciación de genoma completo, determinamos los marcadores genéticos de la resistencia antibiótica de los aislados del secuenciotipo ST175. Todos los aislados estudiados Resumen de la tesis 10 excepto aquel sensible a ceftazidima, mostraron hiperexpresión de ampC, causada por una nueva mutación en AmpR (G154R), y la resistencia a carbapenems correlacionó bien con la inactivación de oprD. Emergieron mutaciones en ftsI (PBP3) de forma independiente en tres aislados del ST175, sugiriendo que la PBP3 se encuentra bajo presión mutacional, y el aislado que mostró una sustitución en PBP1b, localizada en un residuo muy conservado, presenta mayor resistencia en general a cefalosporinas, penicilinas y monobactámicos. Además, todos los aislados mostraron la mutación en MexZ (G195E), responsable de la hiperproducción de MexXY y, de forma adicional, algunos aislados mostraron una sustitucion en mexX que parece afectar al perfil de sustratos. Además, uno de los aislados mostró una mutación inactivante en mexA asociada a la hipersensibilidad a la mayoría de los b-lactámicos. Todos los aislados españoles mostraron una mayor resistencia a quinolonas relacionada con la presencia de una mutación (D87N) adicional a las mutaciones clásicas en GyrA (T83I). Además, todos los aislados presentaron un integrón de clase 1 portador del gen aadB, responsable de la resistencia a gentamicina y tobramicina, y sensibilidad a amikacina y, exceptuando los aislados procedentes de Cantabria, todos los aislados españoles presentaron una mutación en GlpT (L211P) relacionada con la resistencia a fosfomicina. Con el fin de descifrar las trayectorias evolutivas que conducen a una resistencia de alto nivel a agentes antipseudomónicos de diferentes clases, tanto clásicos como nuevos compuestos tales como el ceftolozano, usamos el análisis de la secuenciación de genomas completos en mutantes seleccionados tras la exposición secuencial a concentraciones cada vez mayores de antibióticos durante 7 días. Los mutantes seleccionados por exposición a ciprofloxacino mostraron mutaciones en las Regiones Determinantes de Resistencia a Quinolonas (QRDR) e hiperexpresaron bombas de expulsión. Es destacable que, además de las mutaciones clásicas en GyrA y ParC, se encontró una sustitución no descrita previamente en GyrA (E153K). El desarrollo de resistencia de alto nivel a ceftazidima ocurrió fácilmente en la cepa salvaje PAO1, siendo incluso más rápida en la cepa hipermutadora PAOMS, mientras que ocurrió de forma mucho más lenta y alcanzando niveles menores tras los 7 días de exposición, en el caso de los derivados de PAOAC (mutante deficiente en ampC) y PAOAG (mutante deficiente en ampG), ambos incapaces de la producción, o inducción, de la cefalosporinasa cromosómica AmpC. Por el contrario, el desarrollo de resistencia fue mucho más lento para el ceftolozano/tazobactam, llegando solo a 8xCMI después de los 7 días de exposición. El primer paso del desarrollo de la resistencia a ceftolozano/tazobactam fue muy limitado, incluso para la cepa hipermutadora, con concentraciones que alcanzaron solo 1xCMI después del primer día. Los niveles de resistencia de los mutantes derivados de PAO1 y PAOMS fueron resultado de la hiperexpresión de la cefalosporinasa cromosómica AmpC, debida a mutaciones en los enzimas de la vía de reciclaje del péptidoglicano DacB (PBP4), AmpD y/o AmpR. En cambio, como era de esperar, no se encontraron mutaciones en genes involucrados en la regulación de ampC en los derivados de PAOAC ni de PAOAG, lo que reveló un repertorio alternativo de mutaciones de resistencia. Se observaron grandes deleciones de genes cromosómicos, junto con mutaciones que conducen a la modificación de dianas de los b-lactámicos y/o a la hiperproducción o modificación estructural de la bomba de expulsión MexAB-OprM, como primer paso del desarrollo de la resistencia a b-lactámicos independiente de la producción de b- lactamasas. Fue particularmente interesante la detección de mutaciones en la PBP3, Resumen de la tesis 11 que también se documentaron en la selección de mutantes por exposición in vitro a meropenem. Todos los mutantes seleccionados tras la exposición a meropenem mostraron mutaciones inactivantes de oprD, además de mutaciones en mexR o nalD, resultantes en la hiperproducción de MexAB-OprM y sensibilidad reducida a b-lactámicos y quinolonas. Así pues, la exposición a meropenem seleccionó perfiles de multirresistencia y los resultados indicaron que la PBP3 es una, inesperada, diana principal para el desarrollo de resistencia a meropenem. Los mutantes de PAO1 seleccionados por exposición a ceftolozano/tazobactam alcanzaron solamente resistencia moderada después de 7 días de exposición y, aunque mostraron un pequeño número de mutaciones, se reveló un gran número de genes con expresión modificada, sin embargo ninguna de las mutaciones o cambios de expresión estaban directamente relacionados con los mecanismos de resistencia clásicos sugiriendo que la resistencia moderada a ceftolozano/tazobactam en PAO1 resulta de mutaciones no específicas con efectos pleiotropicos globales y un importante coste biológico. Los mutantes de PAOMS con resistencia de alto nivel a ceftolozano/tazobactam siempre incluyeron hiperproducción de AmpC, y presentaron de una a cuatro mutaciones en residuos conservados de AmpC, que incrementan las CMIs de ceftolozano/tazobactam y ceftazidima, pero las reducen para piperacilina/tazobactam e imipenem. En general, el impacto en la eficacia biológica fue significantemente menor para ceftazidima que para ciprofloxacino y meropenem, y mucho menor para los mutantes de PAOMS que para los mutantes de PAO1. El trabajo presentado supone un gran avance en el conocimiento de los marcadores genéticos de la resistencia en aislados del clon ST175 de P. aeruginosa, que podría resultar muy útil para el desarrollo de estrategias para la detección de infecciones producidas por el mismo, así como también en las trayectorias evolutivas del desarrollo de resistencia de P. aeruginosa tanto a nuevos compuestos antipseudomónicos o combinaciones, lo que puede ser de utilidad a la hora de diseñar estrategias para el tratamiento de las infecciones por P. aeruginosa.

[eng] P. aeruginosa is intrinsically resistant to many antimicrobials, being able to achieve higher resistance levels due to acquisition of mutations and horizontally transferred resistance determinants, as b-lactamases. So, and although resistance mechanisms to these treatments are unknown, combination of classic antimicrobials with compouds that increase bacterial susceptibility represent a valuable therapeutic tool in addition to the, scarce, new antibiotics like ceftolozane, what seems to be stable against most common mutation driven resistance mechanisms, and would determine a step back in the fight against b-lactam resistance. P. aeruginosa has a non-clonal population structure, with most of the isolates represented by an unique genotype, and some clones, remarkably distributed among multiresistant isolates worldwide distributed, known as high-risk clones (HRC), and showing different resistance mechanisms combinations what explain their success. Among the main international HRC, ST175 clone, widely distributed in multiple European countries and we have scarce information about his resistance mechanisms or if these are shared among different lineages. Thus, objectives of this thesis are to analyse the prevalence and impact of the most common resistance mechanisms of bacteraemia P. aeruginosa isolates and its potential association with multiresistant profiles, through a detailed genetic analysis of epidemiological and resistance markers of multi-drug resistant P. aeruginosa isolates causing infections in Hospitals from different Spanish regions, applying whole genome sequencing techniques to ST175 HRC phylogenetic analysis and resistome study. Another important objective is to decipher the evolutionary paths leading to a high level resistance to different antipseudomonal agents, including the effect on virulence and fitness, also under impact of hypermutator phenotype, and a comparative analysis of dynamics and in vitro resistance mechanisms development to ceftolozane-tazobactam in comparison with other classic antipseudomonic agents. From the multicentric study, with more than 600 bacteraemia producing isolates, that involved 10 Spanish hospitals, hyperexpression of ampC was the most prevalent mechanism, followed by hyperexpression of mexXY-oprM and mexAB-oprM efflux pumps. Carbapenemase production was observed for 1% of isolates, representing 4% of imipenem resistant isolates, what imply an 10-fold increment from carbapenemase production observed in a multicentric study performed in Spain 5 years ago, increment that has been held, as a prevalence of 21% for carbapenemase production among multi-drug resistant (MDR) strains has been described in recent studies. So, multi-drug resistant strains, what lessen the treatment options and therefore risen the risk of an unadequate therapy, among which are HRC as ST175, makes clear the need to know its potential association with an specific resistance and/or virulence profile, what could have a high impact in the P. aeruginosa infection outcome. Through a detailed analysis, that included using whole genome sequencing technics, we determined the genetical markers of antibiotic resistance for isolates of ST175 sequencetype. All studied isolates, except that one susceptible to ceftazidime, showed ampC hyperexpression, caused by a novel mutation in AmpR (G154R), and carbapenem resistance correlated well with oprD inactivation. ftsI (PBP3) mutations emerged independently in three ST175 isolates, suggesting that PBP3 is under mutational pressure, and the isolate with a substitution in PBP1b, located in a very conserved residue, exhibits a higher resistance to cephalosporins, penicillins and monobactams. Furthermore, all isolates showed a mutation in MexZ (G195E), responsible for MexXY hyperproduction and, in addition, some isolates presented a Abstract 13 substitution in mexX what seems to affect the substrate profile. Moreover, one isolate showed an inactivating mutation in mexA associated with hypersusceptibility to most b- lactams. All Spanish isolates showed higher quinolone resistance due to the presence of a additional mutation (D87N) to the classic mutations in GyrA (T83I). Also, all isolates presented a class 1 integron harbouring an aadB gene, responsible for gentamicin and tobramycin resistance, and amikacin susceptibility and, except for those isolates from Cantabrian region, all Spanish isolates showed a mutation in GlpT (L211P), related to phoshpomycin resistance. In order to decipher the evolutionary paths leading to a high level resistance to different class of antipseudomonal agents of different classes, both classic and new compounds like ceftolozane, we used whole genome sequencing analysis in mutants selected after 7-days sequential exposure to higher concentration of antibiotic. Mutants selected upon ciprofloxacin exposure showed mutations in Quinolone Resistance Determinant Regions (QRDR) and hyperexpressed efflux pumps. Specially noteworthy was to found a novel substitution in GyrA (E153K), in addition to classic mutations in GyrA and ParC. High level ceftazidime resistance development occurred easily in wildtype strain PAO1, being even faster in hypermutator strain PAOMS, while was slower and reaching a lower levels after 7 days exposure, for mutants derivates from PAOAC (ampC deficient mutant) and PAOAG (ampG deficient mutant), both incapables of chromosomal cephalosporinase ampC production, or induction. On the contrary, ceftolozane/tazobactam resistance development was much slower, reaching only 8xMIC after 7 days exposure. First step of ceftolozane/tazobactam resistance development was very limited, even for hypermutator strain, reaching only 1xMIC concentrations after the first day. Resistance levels of PAO1 and PAOMS derivative mutants were result of hyperexpression of chromosomal cephalosporinase AmpC, due tu mutations in peptidoglycan recycle path enzymes as DacB (PBP4), AmpD and/or AmpR. On contrary, as expected, we don’t find mutations in ampC regulator genes for PAOAC nor PAOAG derivatives, what revealed an alternative resistance mutations repertoire. Huge deletions of chromosomal genes were observed, toghether with mutations leading to b- lactam targets modification and/or hyperproduction or structural modification of MexABOprM efflux pump as a first step of b-lactam resistance development independent of b- lactamase production. Detection of PBP3 mutations, also documented in mutants selected by in vitro exposure to meropenem, was particularly interesting. All mutants selected upon meropenem exposure showed inactivating mutations in oprD, in addition to mutations in mexR or nalD, resulting in hyperproduction of MexABOprM and reduced susceptibility to b-lactams and quinolones. Thus, meropenem exposure selected multi-drug resistant profiles and results indicated that PBP3 is an, unexpected, main targetfor meropenem resistance development. PAO1 mutants selected by ceftolozane/tazobactam exposure reached only moderate resistance after 7 days exposure and, although showed a little amount of mutations, a high number of genes with modified expression was revealed, however none of the mutations nor expression modifications were directly related to classic resistance mechanisms, suggesting the ceftolozane/tazobactam moderate resistance in PAO1 emerges from non specific mutations with global pleiotropic effects and a major fitness cost. Abstract 14 High level ceftolozane/tazobactam resistant PAOMS mutants always included AmpC hyperproduction, and showed up to 4 mutations in conserved AmpC residues, what increase ceftolozane/tazobactam and ceftazidime MICs, but decrease those of piperacillin/tazobactam and imipenem. Overall, fitness impact was significantly lower for ceftazidime than for ciprofloxacin and meropenem, and much lower for PAOMS mutatns than for PAO1 ones. This work means a great progress in the knowledge of genetic markers of resistance in P. aeruginosa ST175 clone isolates, what could be very useful for developing strategies to detect infections produced by ST175 clone, and also deepens the understanding of evolutory trajectories of P. aeruginosa resistance development to both new antipseudomonic compounds as well combinations, what could be useful to design strategies for the treatment of P. aeruginosa infections.