Development of novel automated sample treatment techniques coupling with chromatographic methods for determination of flavonoids in natural and manufacturing matrices

Abstract

[eng] Introduction The increasing knowledge of the massive importance of flavonoids as strong antioxidant substances located in the plants, foods, and their manufactured products, as well as their pharmacological behaviour in the prevention and treatment of numerous diseases in the human and animal bodies, are lead to increase the interesting of the development of many products in the markets such as pharmaceutical and dietary supplement products besides the food-rich flavonoids products such as beverages, jams, and juices. This swiftly growing of the flavonoids commercial industry needs to the adjustment of these products’ quality, detecting the impurities, degradation, and the real concentration of the interesting compounds. However, the complexity of the natural matrices and the sensitivity of flavonoids to the processing factors such as the temperature, mechanism’s harvest, and storage conditions pose difficulties in the extraction and the accurate determination of these compounds, especially when the interesting analytes are present in a trace concentration as in the case of impurities or the decomposition of the analytes. In this sense, sample pretreatment steps are almost mandatory prior to the detection technique application. The new trend is focused on the development of sample pretreatment methods that can be saved in solvents, sample, and time consumptions being as protecting the environment. Nowadays, microextraction techniques and the automation of the sample pretreatment procedure are the trends these days. Flow analysis techniques can be facilitating these interested procedures achieving efficient, fast, economical, workers and environmental protections, besides the increase of the throughput of the sample and the method’s robustness. Thesis content In this thesis, different automatic micro-extraction methods based on flow techniques for the flavonoid’s matrices sample treatments, and HPLC methods have been developed for the determination of flavonoids in their natural sources and commercial products. Flow systems, in particular, were depended on the lab-on-valve, multi-position valve, and multisyringe flow injection analysis followed by HPLC-DAD analysis for exploiting fully automated analytical methods. The potential of flow analytical techniques has proven by the development of two sample pretreatment systems benefiting from the great features of the grafted micro-extraction column of the lab-on-valve platform, multi-position valve, and also from the 3D printer technology. The developed systems have been implanted for the extraction, preconcentration, and determination of flavonoids in pharmaceuticals, dietary supplements, citrus fruits, citrus hand squeezing juices, and their commercial products. Conclusion All the developed systems proved the significant reduction of sample and solvents consumptions and enhancing the sample throughput, sensitivity, and reducibility of the analysis compared with the previous classical methods. The hyphenated HPLC and flow techniques attained fast, selective, and robust fully automated analytical systems. Additionally, a comprehensive review compared effectively between the developed methods and the works that have been existing in the literature.

[spa] Introducción El creciente conocimiento de la enorme importancia de los flavonoides como potentes sustancias antioxidantes ubicadas en plantas, alimentos y sus productos manufacturados, así como su comportamiento farmacológico en la prevención y tratamiento de numerosas enfermedades en el cuerpo humano y animal, han llevado a incrementar el interés del desarrollo de muchos productos en los mercados tales como productos farmacéuticos y suplementos dietéticos, además de productos ricos en flavonoides como bebidas, mermeladas y zumos.

Este rápido crecimiento de la industria comercial de flavonoides necesita el ajuste de la calidad de estos productos, detectando la presencia de impurezas, la degradación y la concentración real de los compuestos de interés.

La complejidad de las matrices naturales y la sensibilidad de los flavonoides a los factores de procesamiento, tales como la temperatura, el mecanismo de recolección y las condiciones de almacenamiento, plantean dificultades en la extracción y determinación precisa de estos compuestos, especialmente cuando los analitos están presentes a niveles de trazas como en el caso de impurezas o productos de descomposición de los analitos. En este sentido, los pasos de pretratamiento de la muestra son casi obligatorios antes de la aplicación de la técnica de detección. La nueva tendencia se centra en el desarrollo de métodos de pretratamiento de muestras más amigables con el medio ambiente. Es por ello que las técnicas de microextracción y la automatización del procedimiento de pretratamiento de muestras son la tendencia de estos días. Las técnicas de análisis en flujo pueden facilitar estos procedimientos logrando métodos más eficientes, rápidos, robustos económicos y seguros para los trabajadores y el medio ambiente. Contenido de la investigación En esta tesis se han desarrollado diferentes métodos automáticos de microextracción basados en técnicas en flujo para los tratamientos de muestras de matrices de flavonoides, y métodos de cromatografía líquida de alta resolución (siglas en inglés HPLC) para la determinación de flavonoides en sus fuentes naturales y productos comerciales. Los sistemas basados en flujo, en particular, se basan en el uso de inyección en válvula solenoide, válvulas de múltiples posiciones y de múltiples jeringas conectadas a sistemas HPLC con detección ultra violeta y arreglo de diodos (siglas en inglés DAD) a fin de desarrollar métodos analíticos totalmente automatizados. El potencial de las técnicas analíticas en flujo se ha demostrado mediante el pretratamiento de muestras en micro columnas de extracción en fase sólida insertadas en sistemas Lab-On-Valve (LOV, laboratorio en válvula), así como a través del uso de la tecnología de impresión 3D para la elaboración de dispositivos de extracción en fase sólida entre otros accesorios.

Conclusión Los sistemas desarrollados han sido implantados para la extracción, preconcentración y determinación de flavonoides en productos farmacéuticos, complementos dietéticos, frutos cítricos (incluyendo pulpa, zumos y piel) y sus productos comerciales. El acoplamiento de las técnicas de flujo y HPLC han permitido desarrollar sistemas analíticos completamente automatizados rápidos, selectivos y robustos.

[cat] Introducció El creixent coneixement de l'enorme importància dels flavonoides com a potents substàncies antioxidants ubicades en plantes, aliments i els seus productes manufacturats, així com el seu comportament farmacològic en la prevenció i tractament de nombroses malalties en el cos humà i animal, han portat a incrementar l'interès del desenvolupament de molts productes en els mercats, com ara productes farmacèutics i suplements dietètics, a més de productes rics en flavonoides, com begudes, melmelades i sucs.

Aquest ràpid creixement de la indústria comercial de flavonoides necessita l'ajust de la qualitat d'aquests productes, detectant les impureses, la degradació i la concentració real dels compostos interessats. No obstant això, la complexitat de les matrius naturals i la sensibilitat dels flavonoides als factors de processament, com ara la temperatura, el mecanisme de recollida i les condicions d'emmagatzematge, plantegen dificultats en l'extracció i determinació precisa d'aquests compostos, especialment quan els analits d'interès són presents a nivells de traces com en el cas d'impureses o els productes de descomposició dels analits. En aquest sentit, els passos de pretractament de la mostra són gairebé obligatoris abans de l'aplicació de la tècnica de detecció. La nova tendència se centra en el desenvolupament de mètodes de pretractament de mostres més amigables amb el medi ambient.

Les tècniques de micro-extracció i l'automatització del procediment de pretractament de mostres són la tendència d'aquests dies. Les tècniques d'anàlisi de flux poden facilitar aquests procediments aconseguint métodes eficients, ràpides, econòmiques i més segurs per als treballadors i el medi ambient. Contingut de la investigació En aquesta tesi s'han desenvolupat diferents mètodes automàtics de micro-extracció basats en tècniques de flux per als tractaments de mostres de matrius de flavonoides, i mètodes de cromatografia líquida d’alta resolució (sigles en anglès HPLC) per a la determinació de flavonoides en les seves fonts naturals i productes comercials. Els sistemes basats en flux, en particular, es basen en l'ús d'injecció en vàlvula solenoides, vàlvules de múltiples posicions i de múltiples xeringues connectades a sistemes HPLC amb detecció ultraviolada d’arregle de díodes (sigles en anglès DAD) per a l'explotació de mètodes analítics totalmente automatitzats. El potencial de les tècniques analítiques de flux s'ha demostrat mitjançant el desenvolupament de sistemes de pretractament de mostres que es beneficien de les excel·lents característiques de la columna de micro-extracció inserida en un LAB-On-Valve (LOV, laboratori en vàlvula), la vàlvula de múltiples posicions i també de la tecnología d'impressora 3D per a l'elaboració de diversos accessoris. Els sistemes desenvolupats han estat implantats per l'extracció, preconcentració i determinació de flavonoides en productes farmacèutics, complements dietètics, cítrics, espremedores manuals de cítrics i els seus productes comercials.

Conclusió Tots els sistemes desenvolupats han demostrat una reducción significativa dels consums de mostres i dissolvents, i millorat el rendiment de la mostra, la sensibilitat i la reproductibilitat de l'anàlisi en comparació amb els mètodes clàssics anteriors. L'acoblament de les tècniques de flux i HPLC han permès desenvolupar sistemes analítics completament automatitzats ràpids, selectius i robustos. A més, s'ha realitzat una revisió exhaustiva per comparar els mètodes desenvolupats a la tesis amb els treballs que hi ha a la literatura.