High-throughput cultivation of heterotrophic bacteria during a North Sea spring bloom and genomic insights into the genus Winogradskyella

Abstract

[eng] The coastal waters surrounding the Helgoland Island, located in the German bight in the North Sea, experience a yearly spring phytoplankton bloom in parallel with the sunlight and temperature increase. These blooming phenomena induce secondary blooms of planktonic bacteria that trigger the succession of distinct bacterial clades. In this thesis, we focused on the study of the bloom-related microbial diversity and dynamics by means of culture-dependent (tandem approach using Whole Cell MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene phylogenetic reconstruction of recovered isolates) and culture-independent (16S rRNA gene amplicon sequencing, genomic and metagenomic data) methodologies. The culture-dependent approach consisted of a high-throughput cultivation in solid agar plates applied to recover a collection of over 5,000 heterotrophic bacteria linked to the spring bloom waters of Helgoland during 2016. To this purpose, eight different media varying in carbon content and the chemical nature of the organic matter were used. Most of the 4,136 strains identified affiliated with Alphaproteobacteria (40.6%), Gammaproteobacteria (26.9%), Bacteroidetes (13.3%) and Actinobacteria (6.7%). The effort yielded many novel isolates as of the 271 operational phylogenetic units (OPUs) identified, 13 were likely to represent novel genera and 143 novel species. The collection of cultivated isolates of the present thesis led to the isolation of 41 strains affiliated with the genus Winogradskyella belonging to the Flavobacteriia class of the Bacteroidetes phylum. It is known that Flavobacteriia play a major role in the organic matter remineralization of the oceans especially for their capability of complex organic matter degradation such as the algal-derived biomass from spring blooms. Among the abovementioned Winogradskyella isolates that represented ten species we sequenced 15 genomes to investigate their taxonomy and ecology. The phylogenetic, genomic and phenotypic analysis of the isolates revealed that, among the ten different co-existing species in North Sea waters, eight represented novel taxa that we could formally describe. In addition, fifteen Metagenome-Assembled genomes (MAGs) were recovered from samples taken in the same location in the years 2010-2012 and 2016. All MAGs belonged to a unique species, but from a different phylogenetic lineage than the cultures and was classified as a new Candidatus species. With the genome and metagenome

[spa] Las aguas costeras que rodean la isla de Helgoland, ubicada en la ensenada alemana en el Mar del Norte, experimentan anualmente una floración primaveral de fitoplancton en paralelo con el aumento de la luz solar y la temperatura. Estos fenómenos de floración inducen floraciones secundarias de bacterias planctónicas que desencadenan una sucesión de distintos clados bacterianos. En esta tesis, nos centramos en el estudio de la diversidad y la dinámica microbiana relacionada con la floración mediante metodologías dependientes de cultivo (enfoque en tándem utilizando Whole Cell MALDI-TOF MS y reconstrucción filogenética del gen 16S rARN de los aislados recuperados) e independientes del cultivo (secuenciación de amplicones de gene 16S rARN, datos genómicos y metagenómicos). El enfoque dependiente de cultivo consistió en realizar un cultivo de alto rendimiento en placas de agar sólido para recuperar una colección de más de 5.000 bacterias heterótrofas vinculadas a las aguas en floración primaveral de Helgoland durante el año 2016. Para ello, se emplearon ocho medios de cultivo que se diferenciaban entre sí principalmente por la concentración y fuente de carbono. La mayoría de las 4.136 cepas identificadas afiliaron con Alphaproteobacteria (40,6%), Gammaproteobacteria (26,9%), Bacteroidetes (13,3%) y Actinobacteria (6,7%). El esfuerzo realizado resultó en una gran cantidad de nuevos aislamientos puesto que a partir de las 271 unidades filogenéticas operativas (OPU) identificadas, 13 representaron potenciales nuevos géneros y 143 potenciales nuevas especies. La colección de cultivos de la presente tesis condujo al aislamiento de 41 cepas afiliadas al género Winogradskyella pertenecientes a la clase Flavobacteriia del filo Bacteroidetes. Es sabido que las flavobacterias desempeñan un papel importante en la remineralización de la materia orgánica de los océanos, especialmente por su capacidad de degradación de la materia orgánica compleja como la biomasa derivada de algas de las floraciones primaverales. Entre los aislados de Winogradskyella antes mencionados, que representaban diez especies, secuenciamos 15 genomas para investigar su taxonomía y ecología. El análisis filogenético, genómico y fenotípico de los aislamientos reveló que, entre las diez especies diferentes que coexisten en las aguas del Mar del Norte, ocho representaban nuevas especies que describimos formalmente. Abstract 4 Además, se recuperaron quince genomas ensamblados de metagenomas (MAGs) de muestras tomadas en el mismo lugar en los años 2010-2012 y 2016. Todos los MAGs pertenecían a una única especie, pero de un linaje filogenético diferente al de los cultivos y fue clasificado como una nueva especie Candidatus. Con la información de los genomas y metagenomas analizamos sus características genómicas y metabólicas, con especial énfasis en la capacidad de degradar polisacáridos derivados de algas. Las secuencias de los genomas formaron dos linajes principales, el primero representado principalmente por organismos cultivados caracterizados por genomas más grandes ~ 4,3 Mb (± 0,4 Mb) y una gran abundancia y diversidad de Locis de Utilización de Polisacáridos (PULs). Por el contrario, el segundo linaje estuvo representado principalmente por MAGs de ~ 2,3 Mb por genoma y algunos aislados que mostraron genomas entre ~ 3,0 - 3,5 Mb. Este linaje, además de tener genomas más pequeños, mostró menos variedad y número de PULs, revelando que incluso ambos linajes muestran capacidades de degradación, parecen ocupar diferentes nichos y tener diferentes roles en el medio ambiente.

[cat] Les aigües costaneres que envolten l'illa de Helgoland, situada a la cala alemanya al Mar de Nord, experimenten anualment una floració primaveral de fitoplàncton paral·lelament amb l'increment de la llum solar i la temperatura. Aquests fenòmens de florament indueixen floracions secundàries de bacteris planctònics que desencadenen una successió de diferents clades bacterians. En aquesta tesi, ens centrem en l'estudi de la diversitat i la dinàmica microbiana relacionada amb la floració mitjançant metodologies dependents de cultiu (enfocament en tàndem utilitzant Whole Cell MALDI-TOF MS i reconstrucció filogenètica del gen 16S rARN dels aïllats recuperats) i independents de l'cultiu (seqüenciació d’amplicons del gen 16S rARN, dades genòmiques i metagenómicos). L'enfocament dependent de cultiu va consistir en realitzar un cultiu d'alt rendiment en plaques d'agar sòlid per recuperar una col·lecció de més de 5.000 bacteris heteròtrofs vinculats a les aigües en floració primaveral de Helgoland durant l'any 2016. Per a això, es van emprar vuit medis de cultiu que es diferenciaven entre si principalment per la concentració i la font de carboni. La major part de les 4.136 soques identificades van afiliar amb Alphaproteobacteria (40,6%), Gammaproteobacteria (26,9%), Bacteroidetes (13,3%) i Actinobacteria (6,7%). L'esforç realitzat va resultar en una gran quantitat de nous aïllaments ja que a partir de les 271 unitats filogenètiques operatives (OPU) identificades, 13 van representar potencials nous gèneres i 143 potencials noves espècies. La col·lecció de cultius de la present tesi va conduir a l'aïllament de 41 soques afiliades a l'gènere Winogradskyella pertanyents a la classe Flavobacteriia del filum Bacteroidetes. És sabut que els flavobacteris tenen un paper important en la remineralització de la matèria orgànica dels oceans, especialment per la seva capacitat de degradació de la matèria orgànica complexa com la biomassa derivada d'algues de les floracions primaverals. Entre els aïllats de Winogradskyella abans esmentats, que representaven deu espècies, vàrem seqüenciar 15 genomes per investigar la seva taxonomia i ecologia. L'anàlisi filogenètic, genòmic i fenotípic dels aïllaments va revelar que, entre les deu espècies diferents que coexisteixen en les aigües de la Mar del Nord, vuit representaven noves espècies que vàrem descriure formalment. A més, es van recuperar quinze genomes acoblats de metagenomas (MAGs) de mostres preses en el mateix lloc en els anys 2010-2012 i 2016. Tots els MAGs pertanyien a una única espècie, però d'un llinatge filogenètic diferent a la dels cultius i va ser classificat com una nova espècie Candidatus. Amb la informació dels genomes i metagenomes vàrem analitzar les seves característiques genòmiques i metabòliques, amb especial èmfasi en la capacitat de degradar polisacàrids derivats d'algues. Les seqüències dels genomes van formar dos llinatges principals, el primer representat principalment per organismes cultivats caracteritzats per genomes més grans ~ 4,3 Mb (± 0,4 Mb) i amb una gran abundància i diversitat de Locis d'Utilització de Polisacàrids (PULs). Per contra, el segon llinatge va estar representat principalment per MAGs de ~ 2,3 Mb per genoma i alguns aïllats que van mostrar genomes entre ~ 3,0-3,5 Mb. Aquest llinatge, a més de tenir genomes més petits, va mostrar menys diversitat i nombre de PULs, revelant que tot i que els dos llinatges mostren capacitats de degradació, semblen ocupar diferents nínxols i tenir diferents rols en el medi ambient.