Metagenomic characterization of hypersaline anaerobic sediments of S’Avall solar salterns, and evaluation of salinity as selection force in the taxonomic structure of methanogenic consortia

Abstract

[eng] The anaerobic hypersaline sediments of an ephemeral pond from the S’Avall solar salterns constituted an excellent study system because of their easy accessibility, as well as the analogy of their microbial assemblages with some known deep-sea hypersaline anaerobic brines. By means of shotgun metagenomics and 16S rRNA gene amplicon sequencing, the microbial composition of the sediment was shown to be stable in time and space. The communities were formed by prokaryote representatives with an inferred clear anaerobic metabolism, mainly related to the methane, sulfur and nitrate cycles. The most conspicuous finding was the inverted nature of the vertical stratification. Contrarily to what could be expected, a methanogenic archaeal metabolism was found to dominate in the upper layers, whereas Bacteria with fermentative and anaerobic respiration metabolisms increased with depth. We could demonstrate a putative methanogenic nature of the members of candidate lineages DHVE2 and MSBL1, which were present in high abundance in this system, and described, for the first time, viruses infecting these lineages. Members of the aerobic genera Salinibacter and Halorubrum putatively active were detected especially in the deepest layers for which we hypothesize that either oxygen could be sporadically available, or they could perform anaerobic metabolisms. We also report a novel repertoire of virus species thriving in these sediments, which had special relevance because of their lysogenic lifestyles. Sediments underlying the solar salterns of S’Avall have been subjected to the evaluation of abiotic factors as salinity, substrate concentration (Posidonia oceanica) and antibiotic. The sediment composition was analysed by amplicon 16S rRNA gene sequencing. Salinity acted as the major selection force to structure microbial communities, influenced by ampicillin, that exerted a selective pressure, and the use of distinct concentrations of P. oceanica, which displayed a weaker effect. At high salinities, communities were dominated by extreme halophilic Archaea, whereas bacterial alpha diversity decreased with salinity, being highest at 5%. Besides, among the most competitive taxa and their metabolic role in the ecosystem, overall sulfate-reducers decreased with salinity and in turn methanogens increased as salt concentration did, especially at 25% were only methanogens dominated. Beta diversity between communities in microcosms with and without ampicillin displayed an increasing trend with dilution, although its real effect could be partially hidden by the salinity factor. However, no important effect was observed of carbon substrate concentration. Deterministic ecological factors did not affect microbial community assemblies, whereas stochastic processes predominantly prevailed on the microbial dynamics of the sediment as salinity increased. Dilution applied to the slurry (initial conditions), ranging from 30% to 5% of salinity (at which the highest compositional changes were detected) was the most relevant ecological factor. Abstract 2 Microbial communities from sediments of S’Avall demonstrated an understudied potential in methanogenesis, and halophilic methanogenic consortia from enriched microcosms were described in this study by means of metagenomics. With a broad range in cultivability requirements at eight different salinities, distinct substrate concentrations and ampicillin, the most efficient microcosms were selected in accordance to gas methane measurement through gas chromatography. These enrichments were subcultured and supplemented with organic compounds (acetate, formate and trimethylamine: ATF), which enhanced the methane production. The results showed the highest methane yield in microcosms at 5% of salinity with ampicillin and 10% w/w P. oceanica, and even more the supplemented with ATF, obtaining higher methane rates in comparison to reported until now. Among the prokaryotic diversity regarding the ATF supplement availability, Methanosarcina was more abundant in the no supplemented enrichment, whereas Methanoculleus with ATF. These genera within Methanomicrobia showed a taxonomic turnover in accordance to the supplement disposal. Besides, aceticlastic Methanoculleus genus exhibited high replication activity in comparison to the metabolically versatile Methanosarcina, which can produce methane using any of the methanogenesis pathways. Additionally, new members of Bathyarchaeia and Lokiarchaeia were also able to produce methane, specially Bathyarchaeia in the no-ATF supplemented enrichment and the putative hydrogenotrophic Lokiarchaeia class in the supplemented one. In fact, methanogenesis was performed mainly via aceticlastic route, with Methanomicrobia and Bathyarchaeia as the most representative, and the supplement based on the addition of acetate, trimethylamine and formate could be mainly metabolized by members affiliated with Methanomicrobia and Lokiarchaeia.

[spa] Los sedimentos hipersalinos anaerobios de un estanque efímero de las salinas solares de S’Avall constituyeron un excelente sistema de estudio por su fácil accesibilidad, así como por la analogía de sus ensamblajes microbianos con algunos de salmueras anaerobias hipersalinas de aguas profundas conocidas (DHABS). Se demostró la estabilidad temporal y espacial de la composición microbiana del sedimento, mediante metagenómica y la secuenciación del amplicón del gen del ARNr 16S. Las comunidades estaban compuestas por representantes procariotas con un claro metabolismo anaerobio inferido, relacionado principalmente con los ciclos del metano, azufre y nitrato. El hallazgo más notorio fue la naturaleza invertida de la estratificación vertical. Contrariamente a lo que podría esperarse, se encontró que un metabolismo llevado a cabo por Archaea metanogénicas dominaba en las capas superiores, mientras que las bacterias con metabolismos respiratorios fermentativos y anaeróbicos aumentaron con la profundidad. Pudimos demostrar un comportamiento putativamente metanógeno para los miembros de los linajes candidatos DHVE2 y MSBL1, que eran muy abundantes en este sistema, y se describió, por primera vez, virus que infectan estos linajes. Se detectaron miembros de los géneros aerobios Salinibacter y Halorubrum supuestamente activos, especialmente en las capas más profundas, por lo que planteamos las hipótesis de que el oxígeno podría estar disponible esporádicamente o que estos microorganismos podrían realizar metabolismos anaerobios. Un repertorio novedoso de especies de virus que prosperan en estos sedimentos también fue encontrado, los cuales tuvieron especial relevancia debido a sus estilos de vida lisogénicos. Los sedimentos subyacentes a las salinas solares de S’Avall se han sometido a la evaluación de factores abióticos como la salinidad, la concentración de sustrato (Posidonia oceanica) y antibiótico. La composición del sedimento se analizó mediante secuenciación del gen del ARNr 16S. La salinidad actuó como la fuerza principal de selección para estructurar las comunidades microbianas, influenciadas por la ampicilina, que ejerció una presión selectiva, y el uso de distintas concentraciones de P. oceanica, que mostraron un efecto más débil. En altas salinidades, las comunidades estuvieron dominadas por Archaea extremadamente halófilas, mientras que la diversidad alfa bacteriana disminuyó con la salinidad, siendo más alta al 5%. Además, entre los taxones más competitivos y su función metabólica en el ecosistema, en general los reductores de sulfato disminuyeron con la salinidad y, a su vez, los metanógenos aumentaron con la concentración de sal, especialmente al 25% dónde sólo dominaron los metanógenos. La beta-diversidad entre las comunidades de los microcosmos con y sin ampicilina mostró una tendencia creciente con la dilución, aunque su efecto real podría estar parcialmente oculto por el factor de salinidad. Sin embargo, no se observó ningún efecto importante proveniente de la concentración de sustrato de carbono. Los factores ecológicos deterministas no afectaron a los ensamblajes de comunidades microbianas, mientras que los procesos estocásticos prevalecieron Abstract 4 predominantemente sobre la dinámica microbiana del sedimento a medida que aumentaba la salinidad. La dilución aplicada al sedimento (en condiciones iniciales), la cual variaba del 30% al 5% de salinidad (en la que se detectaron los mayores cambios de composición) fue el factor ecológico más relevante. Las comunidades microbianas de los sedimentos de S’Avall demostraron un potencial poco estudiado en la metanogénesis, y en este estudio se describieron consorcios metanogénicos halófilos a partir de microcosmos enriquecidos mediante metagenómica. Con una amplia gama de requisitos de cultivabilidad, a ocho salinidades diferentes, distintas concentraciones de sustrato y ampicilina, los microcosmos más eficientes fueron seleccionados de acuerdo a la medición de gas metano mediante cromatografía de gases. Estos enriquecimientos fueron subcultivados y suplementados con compuestos orgánicos (acetato, formiato y trimetilamina: ATF), que potenciaron la producción de metano. Los resultados mostraron el mayor rendimiento en metano en los microcosmos al 5% de salinidad con ampicilina y 10% de P. oceanica, y aún más en el suplementado con ATF, obteniendo tasas de metano más altas en comparación a lo descrito hasta el momento. Entre la diversidad procariota con respecto a la disponibilidad del suplemento ATF, Methanosarcina fue más abundante en el enriquecimiento no suplementado, mientras que Methanoculleus con ATF. Estos géneros pertenecientes a Methanomicrobia mostraron una clara evidencia de un recambio taxonómico entre ellos, de acuerdo con el suplemento disponible. Además, el género aceticlástico Methanoculleus exhibió una alta actividad de replicación en comparación con Methanosarcina, muy versátil metabólicamente por su capacidad de producir metano utilizando cualquiera de las vías de la metanogénesis. Además, los nuevos miembros de Bathyarchaeia y Lokiarchaeia también fueron capaces de generar gas metano, especialmente Bathyarchaeia en el enriquecimiento sin ATF y la clase hidrogenotrófica putativa Lokiarchaeia en el suplementado. De hecho, la metanogénesis se llevó a cabo principalmente por la vía aceticlástica, con Methanomicrobia y Bathyarchaeia como las comunidades microbianas más representativas, y el suplemento basado en la adición de acetato, trimetilamina y formiato pudo ser metabolizado principalmente por miembros afiliados a Methanomicrobia and Lokiarchaeia.

[cat] Els sediments hipersalins anaerobis d’un estany efímer de les salines de S’Avall van constituir un sistema d’estudi excel·lent per la seva fàcil accessibilitat, així com l’analogia dels seus acoblaments microbians amb els d’algunes salmorres anaeròbies hipersalines d’aigües profundes conegudes (DHABS). L’estabilitat temporal i espacial en la composició microbiana del sediment es va demostrar mitjançant metagenòmica i la seqüenciació del gen de l’ARNr 16S. Les comunitats estaven compostes per representants procariotes amb un clar metabolisme anaerobi inferit, relacionat principalment amb els cicles del metà, sofre i nitrat. La troballa més notòria va ser la naturalesa invertida de l'estratificació vertical. Contràriament al que es podria esperar, es va trobar que un metabolisme dut a terme per Archaea metanògenes dominava a les capes superiors, mentre que els bacteris amb metabolismes respiratoris fermentatius i anaeròbics van augmentar amb la profunditat. Vam poder demostrar un comportament putativament metanògen per als membres dels llinatges candidats DHVE2 i MSBL1, que eren molt abundants en aquest sistema, i es va descriure, per primera vegada, virus que infecten aquests llinatges. Es van detectar membres dels gèneres aerobis Salinibacter i Halorubrum suposadament actius, especialment a les capes més profundes, per la qual cosa plantegem les hipòtesis que l’oxigen podria estar disponible esporàdicament o que aquests microorganismes podrien realitzar metabolismes anaerobis. Un repertori innovador d’espècies víriques que prosperen en aquests sediments també va ser trobat, les quals van tenir especial rellevància a causa dels seus estils de vida lisogènics. Els sediments subjacents a les salines solars de S’Avall han estat sotmesos a l’avaluació de factors abiòtics com la salinitat, la concentració de substrat (Posidonia oceanica) i antibiòtic. La composició del sediment es va analitzar mitjançant la seqüenciació del gen de l'ARNr de l'amplicó 16S. La salinitat va actuar com la força principal de selecció per a estructurar les comunitats microbianes, influenciades per l’ampicil·lina, que va exercir una pressió selectiva, i l’ús de diferents concentracions de P. oceanica, les quals van mostrar un efecte més feble. A elevades salinitats, les comunitats van estar dominades per Archaea extremadament halòfiles, mentre que la diversitat alfa bacteriana va disminuir amb la salinitat, essent més alta al 5%. A més, entre els tàxons més competitius i la seva funció metabòlica a l’ecosistema, en general els reductors de sulfat van disminuir amb la salinitat i, alhora, els metanògens van augmentar amb la concentració de sal, especialment al 25% on només van dominar els metanògens. La beta-diversitat entre les comunitats dels microcosmos amb ampicil·lina i sense va mostrar una tendència creixent amb la dilució, encara que el seu efecte real podria estar parcialment ocult pel factor de salinitat. No obstant això, no es va observar cap efecte important provinent de la concentració de substrat de carboni. Els factors ecològics deterministes no van afectar als assemblatges de les comunitats microbianes, mentre que els processos estocàstics van prevaldre predominantment sobre la dinàmica microbiana del sediment a mesura que augmentava la salinitat. La dilució aplicada al Abstract 6 sediment (en condicions inicials), la qual variava del 30% al 5% de salinitat (en què es van detectar els majors canvis de composició) va ser el factor ecològic més rellevant. Les comunitats microbianes dels sediments de S’Avall van demostrar un potencial poc estudiat a la metanogènesi, i en aquest estudi es van descriure consorcis metanogènics halòfils a partir de microcosmos enriquits mitjançant metagenòmica. Amb una àmplia gamma de requisits de cultivabilitat, a vuit salinitats diferents, distintes concentracions de substrat i ampicil·lina, els microcosmos més eficients van ser seleccionats d’acord amb el mesurament de gas metà mitjançant cromatografia de gasos. Aquests enriquiments van ser subcultivats i suplementats amb compostos orgànics (acetat, formiat i trimetilamina: ATF), que van potenciar la producció de metà. Els resultats van mostrar el major rendiment en metà als microcosmos al 5% de salinitat amb ampicil·lina i 10% P. oceanica, i encara més al suplementat amb ATF, obtenint taxes de metà més altes en comparació al que s’ha descrit fins ara. Entre la diversitat procariota d’acord a la disponibilitat del suplement ATF, Methanosarcina va ser més abundant a l’enriquiment no suplementat, mentre que Methanoculleus amb ATF. Aquests gèneres pertanyents a Methanomicrobia van mostrar una evidència clara d’un recanvi taxonòmic entre ells, d’acord amb el suplement disponible. A més, el gènere aceticlàstic Methanoculleus va exhibir una alta activitat de replicació en comparació amb Methanosarcina, molt versàtil metabòlicament per la seva capacitat de produir metà utilitzant qualsevol de les vies de la metanogènesi. A més, els nous membres trobats de Bathyarchaeia i Lokiarchaeia també van ser capaços de generar gas metà, especialment Bathyarchaeia a l’enriquiment sense ATF i la classe hidrogenotròfica putativa Lokiarchaeia al suplementat. De fet, la metanogènesi es va dur a terme principalment per la via aceticlàstica, amb Methanomicrobia i Bathyarchaeia com les comunitats microbianes més representatives, i el suplement basat en l’adició d’acetat, trimetilamina i formiat va poder ser metabolitzat principalment per membres afiliats a Methanomicrobia i Lokiarchaeia.