Platelet-derived extracellular vesicles for bone regeneration applications

Abstract

[eng] Extracellular vesicles (EVs) are cell secreted nanoparticles involved in cellular communication that contain highly active biomolecules. In this thesis we propose the use of those EVs secreted by platelets (pEVs) as new therapeutical tools for regenerative medicine, in particular, for bone tissue regeneration applications in the orthopaedical and maxillofacial surgery fields. In this work, size exclusion chromatography was selected as the main pEV isolation method, after evaluating their physicochemical characteristics and osteogenic effect. In vitro experiments were performed on mesenchymal stem cells, in addition to fibroblasts and keratinocytes cell lines. Overall, gene expression and regeneration effects were improved for all pEV treated groups. However, for clinical application, a pEV based biomaterial would be more desirable since they could allow a local and sustained treatment in comparison with pEV direct use. Therefore, here, two different biomaterials were designed and evaluated. On the one hand, pEVs were tested for direct titanium surface binding. A drop casting method was developed, optimizing the different conditions to avoid harming the pEVs while allowing an efficient union. Moreover, nanostructured surfaces and dopamine coated surfaces were also tested. Nonetheless, these three different approaches for titanium functionalization with pEVs turned out to present differences in their functional effects since some subpopulations were preferentially linked to the surface. On the other hand, a gel-based material was developed by entrapping pEVs in a hyaluronic acid solution. In this case, pEVs release and equilibrium swelling ratio were determined. Moreover, the gels were also tested in vitro, showing improved effects compared with pEV’s direct use. Overall, both methods, titanium implants covering and hyaluronic acid gel formulation, were successfully implemented, but the formulated gels were selected for further analysis in order to maintain the effect of all pEVs subpopulations. Hence, pEV formulated gels were evaluated in vivo during the surgical implantation of Ti discs on the tibial bone of New Zealand White rabbits. The osteoregenerative response was evaluated after eight weeks of healing using molecular biology techniques, bone imaging and functional tests. The results suggest that pEV formulated gels improve bone healing, since the fibrotic tissue surrounding the implant was diminished and biocompatible indicators were improved in contrast to non-functionalized hyaluronic acid. In addition, bone regeneration was further advanced in pEV treated groups according to biochemical and histological analyses. In conclusion, pEVs are promising bone healing therapeutical effectors that can improve the existing biomaterials performance. However, it is still desirable to improve the obtention processes to be able to achieve higher concentrations of pEVs and assure more robust in vivo results. Overall, pEVs present interesting therapeutical effects and can be easily combined with different biomaterials. Therefore, their further evaluation and study would benefit the clinical field for orthopaedical and dental applications.

[spa] Las vesículas extracelulares (EVs) son nanopartículas naturales implicadas en la comunicación celular, que contienen biomoléculas altamente activas. En esta tesis, proponemos el uso de las EV secretadas por plaquetas (pEVs) como nuevas herramientas terapéuticas para la medicina regenerativa, en particular, para aplicaciones de regeneración del tejido óseo en los campos de la cirugía ortopédica y maxilofacial. En este trabajo, se seleccionó la cromatografía de exclusión por tamaño como principal método de aislamiento de pEV, después de evaluar sus características fisicoquímicas y su efecto osteogénico. Se realizaron experimentos in vitro con células madre mesenquimales, además de líneas celulares de fibroblastos y queratinocitos. En ellos, se observaron mejoras en la expresión génica y en los efectos regenerativos para todos los grupos tratados con pEV. Sin embargo, para la aplicación clínica, un biomaterial basado en pEV sería más deseable, puesto que permitiría un tratamiento local y sostenido en el tiempo, en comparación con el uso directo de pEV. Por este motivo, a continuación, se diseñaron y evaluaron dos biomateriales diferentes. Por un lado, se testó la unión directa de las pEV en la superficie de titanio. Se desarrolló un método de drop-casting, optimizando las diferentes condiciones para evitar dañar las pEV, alcanzando a la vez una unión eficiente. Además, también se evaluaron superficies nanoestructuradas y superficies recubiertas de dopamina. Sin embargo, estas tres aproximaciones para la unión de las pEV al titanio presentaron diferencias en su funcionalidad, puesto que algunas subpoblaciones de EV estaban vinculadas preferentemente a la superficie. Por otra parte, se desarrolló un material tipo gel, atrapando a las pEV en una solución de ácido hialurónico. En ese caso, se determinó la liberación de pEV y el grado de hinchamiento en el equilibrio. Además, los geles también se probaron in vitro, mostrando mejores efectos en comparación con el uso directo de pEV. Por lo general, ambos métodos, el recubrimiento de implantes de titanio y la formulación de geles de ácido hialurónico, se implementaron con éxito, pero los geles formulados se seleccionaron para los análisis posteriores debido a que mantenían el efecto de todas las subpoblaciones de pEV. De esta forma, los geles formulados con pEV se evaluaron in vivo durante la implantación quirúrgica de discos de Ti en el hueso tibial en conejos. La respuesta osteoregenerativa se evaluó tras ocho semanas de cicatrización mediante técnicas de biología molecular, imágenes óseas y pruebas funcionales. Los resultados sugieren que los geles formulados con pEV mejoran la cicatrización ósea, ya que disminuyó el tejido fibrótico que rodea el implante y también mejoraron los indicadores de biocompatibilidad, a diferencia de los conejos tratados con ácido hialurónico no funcionalizado. Además, la regeneración ósea avanzó más en grupos tratados con pEV, según los análisis bioquímicos e histológicos. En conclusión, las pEV presentan efectos terapéuticos prometedores de curación ósea que pueden mejorar el rendimiento de los biomateriales existentes. Sin embargo, todavía es deseable mejorar los procesos de obtención para poder alcanzar concentraciones más altas de pEVs y asegurar resultados in vivo más robustos. En general, las pEV presentan efectos terapéuticos de gran interés y se pueden combinar fácilmente con diferentes biomateriales. Por tanto, su evaluación y estudio adicionales beneficiarían al ámbito clínico para aplicaciones ortopédicas y dentales.

[cat] Les vesícules extracel·lulars (EVs) són nanopartícules naturals implicades en la comunicació cel·lular i que contenen biomolècules altament actives. En aquesta tesi, proposem l'ús de les EV secretats per plaquetes (pEVs) com a noves eines terapèutiques per a la medicina regenerativa, en particular, per a aplicacions de regeneració del teixit ossi en els camps de la cirurgia ortopèdica i maxil·lofacial. En aquest treball, es va seleccionar la cromatografia d'exclusió de mida com a principal mètode d'aïllament de pEV, després d'avaluar-ne les característiques fisicoquímiques i l'efecte osteogènic. Es van realitzar experiments in vitro amb cèl·lules mare mesenquimals, a més de línies cel·lulars de fibroblasts i queratinòcits. En general, es van observar millores en l'expressió gènica i en els efectes regeneratius per a tots els grups tractats amb pEV. Tanmateix, per a l'aplicació clínica, un biomaterial basat en pEV seria més desitjable, ja que permetria un tractament local i sostingut en el temps, en comparació amb l'ús directe de pEV. Per tant, a continuació, es van dissenyar i avaluar dos biomaterials diferents. D'una banda, es va testar la unió directa de les pEV a la superfície de titani. Es va desenvolupar un mètode de drop-casting, optimitzant les diferents condicions per evitar malmetre les pEV alhora que s’assoleix una unió eficient. A més a més, també es varen avaluar superfícies nanoestructurades i superfícies recobertes de dopamina. No obstant això, aquestes tres aproximacions per a la unió de les pEVs al titani van presentar diferències en la seva funcionalitat, ja que algunes subpoblacions estaven vinculades preferentment a la superfície. D'altra banda, es va desenvolupar un material a base de gel, atrapant les pEV en una solució d'àcid hialurònic. En aquest cas, es va determinar l'alliberament de pEV i el grau d’inflament a l’equilibri. A més a més, els gels també es van provar in vitro, mostrant millors efectes en comparació amb l'ús directe de pEV. En general, ambdós mètodes, la funcionalització d'implants de titani i la formulació de gel d'àcid hialurònic, es van implementar amb èxit, però els gels formulats es van seleccionar per als anàlisis posterior pel fet que mantenien l'efecte de totes les subpoblacions de pEV. D’aquesta manera, els gels formulats amb pEV es van avaluar in vivo durant la implantació quirúrgica de discs de Ti a l'os tibial de conills . La resposta osteoregenerativa es va avaluar després de vuit setmanes de cicatrització mitjançant tècniques de biologia molecular, imatges òssies i proves funcionals. Els resultats suggereixen que els gels formulats amb pEV milloren la cicatrització òssia, ja que va disminuir el teixit fibròtic que envolta l'implant i també van millorar els indicadors de biocompatibilitat, a diferència dels conills tractats amb àcid hialurònic no funcionalitzat. A més a més, la regeneració òssia va avançar més en el grup tractats amb pEV, segons les anàlisis bioquímiques i histològiques. En conclusió, les pEV presenten efectes terapèutics prometedors de curació òssia que poden millorar el rendiment dels biomaterials existents. Tot i així, encara és desitjable millorar els processos d'obtenció per poder aconseguir concentracions més altes de pEVs i assegurar resultats in vivo més robusts. En general, les pEV presenten efectes terapèutics de gran interès i es poden combinar fàcilment amb diferents biomaterials. Per tant, la seva avaluació i estudis addicionals beneficiarien l'àmbit clínic per a aplicacions ortopèdiques i dentals.