Extracellular vesicles for cell-free regenerative medicine and its application for treatment of osteoarthritis

Abstract

[eng] Osteoarthritis (OA) is an articular cartilage degenerative joint disease with no current disease modifying treatments or successful regenerative therapies. Current regenerative therapies for OA are cell-based treatments, such as Autologous Chondrocyte Implantation (ACI) or Mesenchymal Stem Cells (MSCs) therapies, which present drawbacks that compromise its application to all OA patients. On the other hand, more common treatments include analgesic and non-steroid anti-inflammatory drugs, hyaluronic acid injections to help lubricate the joint area or platelet-rich plasma (PRP) injections. PRP are concentrates of plasma enriched in platelets, which are known to play a key role in wound healing processes. Moreover, platelets contain a high concentration of osteogenic growth factors with proven regenerative potential. However, its autologous use leads to a high variability from patient-to-patient. Furthermore, there is no consensus or standardised protocol to store and apply PRP in clinics. Since both, MSC-based therapies and non-MSC-based therapies, present serious limitations for their translation to clinics, other options need to be explored in the field of OA regenerative treatments. Extracellular Vesicles (EVs) have emerged as a promising alternative to cell-based treatments in regenerative medicine. EVs are membranous nanoparticles naturally secreted by all kind of cells and which function is cell-to-cell communication. EVs contain a diversity of active biomolecules protected from in vivo degradation thanks to their membrane, and since their main function is related to cell-to-cell communication they directly exert their effect onto their target cells, which is the feature of interest in the therapeutic applications. Thus, this Thesis aims to evaluate platelet lysate (PL)-derived EVs (pEVs) and human umbilical cord MSC-derived EVs (cEVs) as a cell-free regenerative treatment for OA. The isolation of EVs is a critical factor that influences their functionality. Ultracentrifugation, as gold standard isolation method, has limitations such as co-isolation of non-EV contaminants and potential damage to EV integrity. Therefore, size-exclusion chromatography (SEC) was explored in this Thesis as an alternative isolation method. EVs obtained from both ultracentrifugation and SEC were compared in terms of their regenerative effects in an OA in vitro model. SEC-derived EVs showed improved beneficial effects on the chondrocytes compared to ultracentrifuged derived EVs, which presented co-isolated deleterious proteins, highlighting the importance of working with well-purified EV preparations to observe their therapeutic effects accurately. To evaluate the regenerative potential of pEVs and cEVs, ex vivo and in vivo OA models were established using human cartilage explants from cadaveric donors and osteoarthritic rat knee joints, respectively. pEVs improved the osteoarthritic knee joint integrity and surpassed the regenerative effects of cEVs by promoting collagen deposition, reducing glycosaminoglycan degradation, and improving the integrity of articular cartilage explants, as well as recovering the knee joint integrity, especially in female rats, which exhibited greater susceptibility to OA damage. Overall, this Thesis demonstrates the regenerative potential of pEVs and highlights the use of PL as a feasible alternative EV source to MSCs for OA treatment. Thus, while pEVs are not yet ready for clinical implementation, their potential as cell-free regenerative treatment is undeniable. The findings derived from this Thesis shed light on the pEVs application as cell-free treatment for OA and other degenerative pathologies in the near future.

[spa] La osteoartritis (OA) es una enfermedad degenerativa del cartílago articular que actualmente no tiene tratamientos que modifiquen el curso de la enfermedad ni terapias regenerativas adecuadas. De estas últimas, encontramos la implantación autóloga de condrocitos (ACI) o las terapias con células madre mesenquimales (MSCs), las cuales presentan diversos inconvenientes que comprometen su aplicación de manera general a todos los pacientes con OA. Así pues, los tratamientos más comunes incluyen analgésicos, antiinflamatorios no esteroideos, inyecciones de ácido hialurónico para lubricar el área de la articulación o inyecciones de plasma rico en plaquetas (PRP). El PRP es un concentrado de plasma enriquecido en plaquetas, las cuales se sabe que desempeñan un papel clave en los procesos de cicatrización de heridas. Además, las plaquetas contienen una alta concentración de factores de crecimiento osteogénicos que confieren a las plaquetas de un gran potencial regenerativo. Sin embargo, su uso autólogo conlleva una alta variabilidad entre pacientes. Además, no existe consenso ni protocolo estandarizado para el almacenamiento y uso de PRP en la práctica clínica. Dado que tanto las terapias basadas como no basadas en MSC presentan limitaciones serias para su traslación clínica, es necesario explorar otras opciones en el campo de los tratamientos regenerativos para la OA. Las vesículas extracelulares (EVs) han surgido como una alternativa prometedora a los tratamientos basados en células en medicina regenerativa. Las EVs son nanopartículas membranosas secretadas de forma natural por todo tipo de células, cuya función es la comunicación de célula a célula. Las EVs contienen una diversidad de biomoléculas activas protegidas de la degradación in vivo gracias a su membrana, y dado que su función principal está relacionada con la comunicación celular, ejercen directamente su efecto sobre las células diana, lo cual es la característica de interés en las aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, esta Tesis tiene como objetivo evaluar las EVs derivadas de lisado de plaquetas (pEVs) y de MSC de cordón umbilical (cEVs) como un tratamiento regenerativo libre de células para la OA. El aislamiento de las EVs es un factor crítico que influye en su funcionalidad. La ultracentrifugación, como método de aislamiento de referencia, tiene limitaciones como el co-aislamiento de contaminantes y el posible daño a la integridad de las EVs. Por lo tanto, en esta Tesis se exploró la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) como un método de aislamiento alternativo. Se compararon las EVs obtenidas tanto por ultracentrifugación como por SEC en referencia a capacidad regenerativa en un modelo in vitro de OA. Las EVs obtenidas por SEC mostraron efectos beneficiosos sobre los condrocitos en comparación con las EVs obtenidas por ultracentrifugación, las cuales co-aislaron proteínas nocivas para las células, lo que resalta la importancia de trabajar con preparaciones de EVs bien purificadas para observar con precisión sus efectos terapéuticos. Para evaluar el potencial regenerativo de las pEVs y las cEVs, se establecieron modelos ex vivo e in vivo de OA utilizando explantes de cartílago humano de donantes cadavéricos y articulaciones de rodilla de ratas, respectivamente, a los que se les indujo las condiciones inflamatorias simulando una OA. Las pEVs mejoraron la integridad de la rodilla con OA y superaron los efectos regenerativos de las cEVs al promover la deposición de colágeno, reducir la degradación de glucosaminoglicanos y mejorar la integridad de los explantes de cartílago articular, así como recuperar la integridad de la articulación de la rodilla, especialmente en ratas hembra, que mostraron una mayor susceptibilidad al daño de la OA. En general, esta Tesis demuestra el potencial regenerativo de las pEVs y destaca el uso de PL como una fuente de EVs alternativa viable a las MSCs para el tratamiento de la OA. Por lo tanto, aunque las pEVs aún no están listas para su implementación clínica, su potencial como tratamiento regenerativo libre de células es innegable. Los resultados derivados de esta Tesis facilitan la compresión de las pEVs como tratamiento libre de células para la OA y otras patologías degenerativas en un futuro próximo.

[cat] L'osteoartritis (OA) és una malaltia degenerativa del cartílag articular que actualment no té tractaments que modifiquin el curs de la malaltia ni teràpies regeneratives adequades. D'aquestes últimes, trobem la implantació autòloga de condròcits (ACI) o les teràpies amb cèl·lules mare mesenquimals (MSCs), les quals presenten diversos inconvenients que comprometen la seva aplicació de manera general a tots els pacients amb OA. Així doncs, els tractaments més comuns inclouen analgèsics, antiinflamatoris no esteroides, injeccions d'àcid hialurònic per lubricar l'àrea de l'articulació o injeccions de plasma ric en plaquetes (PRP). El PRP és un concentrat de plasma enriquit en plaquetes, les quals es coneix que juguen un paper clau en els processos de cicatrització de ferides. A més, les plaquetes contenen una alta concentració de factors de creixement osteogènics que les hi atorguen un gran potencial regeneratiu. No obstant això, el seu ús autòleg comporta una alta variabilitat entre pacients. A més, no existeix consens ni protocol estandarditzat per a l'emmagatzematge i ús del PRP en la pràctica clínica. Donat que tant les teràpies basades com les no basades en MSC presenten limitacions importants per a la seva translació clínica, cal explorar altres opcions en el camp dels tractaments regeneratius per a l'OA. Les vesícules extracel·lulars (EVs) han sorgit com una alternativa prometedora als tractaments basats en cèl·lules en medicina regenerativa. Les EVs són nanopartícules membranoses secretades de forma natural per tots els tipus cel·lulars, les quals tenen com a funció la comunicació de cèl·lula a cèl·lula. Les EVs contenen una diversitat de biomolècules actives protegides de la degradació in vivo gràcies a la seva membrana, i donat que la seva funció principal està relacionada amb la comunicació cel·lular, exerceixen directament el seu efecte sobre les cèl·lules diana, la qual cosa és la característica d'interès en les aplicacions terapèutiques. Per tant, aquesta Tesi té com a objectiu avaluar les EVs derivades de lisat de plaquetes (pEVs) i de MSC de cordó umbilical (cEVs) com un tractament regeneratiu lliure de cèl·lules per a l'OA. L'aïllament de les EVs és un factor crític que influeix en la seva funcionalitat. La ultracentrifugació, com a mètode d'aïllament de referència, té limitacions com el co-aïllament de contaminants i el possible dany a la integritat de les EVs. Per tant, en aquesta Tesi s'ha explorat la cromatografia per exclusió de mida (SEC) com a mètode d'aïllament alternatiu. Es van comparar les EVs obtingudes tant per ultracentrifugació com per SEC en referència a la capacitat regenerativa en un model in vitro d'OA. Les EVs obtingudes per SEC van mostrar efectes beneficiosos sobre els condròcits en comparació amb les EVs obtingudes per ultracentrifugació, les quals co-aïllaren proteïnes nocives per a les cèl·lules, la qual cosa ressalta la importància de treballar amb preparacions de EVs ben purificades per observar amb precisió els seus efectes terapèutics. Per avaluar el potencial regeneratiu de les pEVs i les cEVs, es van establir models ex vivo i in vivo d'OA utilitzant explants de cartílag humà de donants cadavèrics i articulacions de genoll de rates, respectivament, a les quals es van induir les condicions inflamatòries simulant una OA. Les pEVs van millorar la integritat del genoll amb OA i van superar els efectes regeneratius de les cEVs en promoure la deposició de col·lagen, reduir la degradació de glicosaminoglicans i millorar la integritat dels explants de cartílag articular, així com recuperar la integritat de l'articulació del genoll, especialment en rates femella, que van mostrar una major susceptibilitat al dany de l'OA. En general, aquesta Tesi demostra el potencial regeneratiu de les pEVs i destaca l'ús de PL com una font de EVs alternativa viable a les MSCs per al tractament de l'OA. Per tant, encara que les pEVs encara no estan llestes per a la seva implementació clínica, el seu potencial com a tractament regeneratiu lliure de cèl·lules és innegable. Els resultats derivats d'aquesta Tesi faciliten la comprensió de les pEVs com a tractament lliure de cèl·lules per a l'OA i altres patologies degeneratives en un futur proper.