Implementación de modelos in vitro de osteoblasto a partir de células mesenquimales

Abstract

[spa] Las células madre mesenquimales son un tipo celular con la capacidad de diferenciarse a ciertos tipos celulares, entre los que se encuentran las células del linaje osteoblástico. Su estudio ha permitido establecer un modelo in vitro de células osteoblásticas que se asemejan a las condiciones fisiológicas óseas. Se pretende utilizar estos modelos para llevar a cabo pruebas experimentales de ciertos tratamientos de enfermedades relacionadas con el desarrollo y el mantenimiento óseo. El proceso de diferenciación viene mediado por diferentes vías señalizadoras, entre la que destaca la vía de señalización de proteínas morfogénicas óseas (BMP). Su activación es responsable de influir en la actividad de factores de transcripción maestros en la diferenciación osteoblástica, como Runx2 y Osterix. Para inducir la diferenciación se han establecido ciertos protocolos donde se emplean dexametasona (Dex), ácido ascórbico (AA) y β-glicerolfosfato (βGP). Este estudio busca proponer una puesta a punto del proceso junto con la posibilidad de utilizar otros reactivos para inducir la diferenciación y comparar diferentes técnicas de análisis, como la técnica de espectrometría de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES), la tinción Alizarin Red y el Quantichrom Calcium Assay Kit. Para ello, se han utilizado tipos de células de origen murino (r-MSC) y humano (hMSC) procedentes de tejido adiposo (Abd) o médula ósea (BM). Se han sometido las células a un tratamiento con Dx-AA-βGP y diferentes concentraciones de suero fetal bovino (FBS) junto con un medio comercial diseñado específicamente para la diferenciación osteoblástica (Ost) y un tratamiento con BMP4 en periodos de tiempo de 10 y/o 21 días. Los resultados muestran que el tratamiento con DxAA-βGP presenta una gran eficacia para inducir la diferenciación osteoblástica de todos los tipos celulares, al igual que el tratamiento con BMP4 y Ost. Reducir la concentración de FBS en el medio hasta un 2% consigue una mayor mineralización del cultivo, siendo una señal de un mayor grado de diferenciación. En cuanto a las técnicas de análisis, la tinción Alizarin Red tiene bastantes limitaciones al ser una técnica semicuantitativa, pero útil para observar la mineralización de las células de manera visual. En cuanto al ICP-AES y el kit de calcio, ambos son igualmente precisos en concentraciones altas, pero el ICP-AES presenta mayor sensibilidad. A nivel de expresión génica, las BM-rMSC presentaron una elevada dispersión de los datos a causa de que se encontraron al límite del levantamiento al llegar a los 10 días de tratamiento. En cuanto a las BM-hMSC, nos encontramos una mayor activación de la expresión génica a los 10 días, manteniéndose con niveles similares de expresión hasta los 21 días, al utilizar un medio comercial diseñado para su diferenciación. Con el resto de los tratamientos no se llegaron a ver diferencias significativas, pero sería interesante ver sus efectos a los 10 días. En cuanto a las Abd-rMSC, en vista a los resultados obtenidos en la deposición de calcio sería sugerente analizar los niveles de expresión génica al no poderse llevar a cabo en este estudio.

[cat] Les cèl·lules mare mesenquimals són un tipus cel·lular amb la capacitat de diferenciar-se a diferents tipus cel·lulars, entre els quals es troben les cèl·lules del llinatge osteoblàstic. El seu estudi ha permès establir un model in vitro de cèl·lules osteoblàstiques que s'assemblen a les condicions fisiològiques òssies. Es pretén utilitzar aquests models per a dur a terme proves experimentals d'uns certs tractaments de malalties relacionades amb el desenvolupament i el manteniment ossi. El procés de diferenciació ve mediat per diferents vies senyalitzadores, entre la qual destaca la via de senyalització de les proteïnes morfogèniques òssies (BMP). La seva activació és responsable d'influir en l'activitat de factors de transcripció mestres en la diferenciació osteoblàstica, com Runx2 i Osterix. Per a induir la diferenciació s'han establert certs protocols on s'empren dexametasona (Dex), àcid ascòrbic (AA) i β-glicerolfosfat (βGP). Aquest estudi pretén dur a terme una posada a punt d’aquest procés juntament amb la possibilitat d'utilitzar altres reactius per a induir la diferenciació i comparar diferents tècniques d'anàlisi, com la tècnica d'espectrometria d'emissió atòmica de plasma acoblat inductivament (ICP-AES), la tinció Alizarin Red i el Quantichrom Calcium Assay Kit. Per a això, s'han utilitzat tipus de cèl·lules d'origen murí (r-MSC) i humà (hMSC) procedents de teixit adipós (Abd) o medul·la òssia (BM). S'han sotmès les cèl·lules a un tractament amb Dx-AA-βGP, diferents concentracions de sèrum fetal boví (FBS) juntament amb un medi comercial dissenyat específicament per a la diferenciació osteoblàstica (Ost) i un tractament amb BMP4 en períodes de temps de 10 i/o 21 dies. Els resultats mostren que el tractament amb Dx-AA-βGP presenta una gran eficàcia per a induir la diferenciació osteoblàstica de tots els tipus cel·lulars, igual que el tractament amb BMP4 i Ost. Reduir la concentració de FBS en el medi fins a un 2% aconsegueix una major mineralització del cultiu, sent un senyal d'un major grau de diferenciació. En quant a les tècniques, la tinció Alizarin Red té bastants limitacions pel fet de ser una tècnica semiquantitativa, però útil per a observar la mineralització de les cèl·lules de manera visual. Quant l’ICPAES i el kit de calci, totes dues són igualment de precises a concentracions altes, però l’ICP-AES presenta major sensibilitat. A nivell d'expressió gènica, les BM-rMSC van presentar una elevada dispersió de les dades a causa que es varen trobar al límit de l'aixecament en arribar als 10 dies de tractament. En quant a les BM-hMSC, ens trobem una major activació de l'expressió gènica als 10 dies, mantenint-se amb nivells similars d'expressió fins als 21 dies, en utilitzar un medi comercial dissenyat per a la seva diferenciació. Amb la resta dels tractaments no es van arribar a veure diferències significatives, però seria interessant veure els seus efectes als 10 dies. En quant a les Abd-rMSC, en vista als resultats obtinguts en la deposició de calci, seria suggeridor analitzar els nivells d'expressió gènica al no poder-se dur a terme en aquest estudi.

[eng] Mesenchymal stem cells are a cell type with the ability to differentiate into certain cell types, including cells of the osteoblastic lineage. Their study has made it possible to establish an in vitro model of osteoblastic cells that resemble bone physiological conditions. It is intended to use these models to carry out experimental tests of certain treatments for diseases related to bone development and maintenance. The differentiation process is mediated by different signaling pathways, highlighting the signaling pathway of bone morphogenic proteins (BMP). Its activation is responsible for influencing the activity of master transcription factors in osteoblast differentiation, such as Runx2 and Osterix. To induce differentiation, certain protocols have been established using dexamethasone (Dex), ascorbic acid (AA) and β-glycerolphosphate (βGP). This study aims to setup this protocol together with the possibility of using other reagents to induce differentiation and to compare different analysis techniques, such as the inductively coupled plasma atomic emission spectrometry technique (ICP-AES), Alizarin Red staining and the Quantichrom Calcium Assay Kit. For this, cell types of murine (r-MSC) and human (hMSC) origin from adipose tissue (Abd) or bone marrow (BM) have been used. The cells were subjected to a treatment with Dx-AA-βGP at different concentrations of fetal bovine serum (FBS) together with a commercial medium specifically designed for osteoblastic differentiation (Ost) and a treatment with BMP4 in periods of time of 10 and 21 days. The results show that treatment with Dx-AA-βGP is highly effective in inducing osteoblastic differentiation of all cell types, as is treatment with BMP4 and Ost. Reducing the concentration of FBS in the medium up to 2% achieves a greater mineralization of the culture, being a sign of a higher degree of differentiation. Regarding analysis techniques, Alizarin Red staining has several limitations as it is a semiquantitative technique. However, it is useful to visually observe cell mineralization. As for the ICP-AES and the calcium kit, both are equally accurate at high concentrations, but the ICP-AES presents greater sensitivity. At the level of gene expression, the BMrMSCs presented a high dispersion of the data because they were at the limit of the uplift after 10 days of treatment. Regarding the BM-hMSC, we found a greater activation of gene expression at 10 days, maintaining similar levels of expression until 21 days, when using a commercial medium designed for their differentiation. With the rest of the treatments, no significant differences were seen, but it would be interesting to see their effects after 10 days. Regarding the Abd-rMSC, in view of the results obtained in calcium deposition, it would be suggestive to analyze the levels of gene expression since it could not be carried out in this study.