Efecte de la formulació i condicions de conservació en la funcionalitat de les vesícules extracel·lulars

Abstract

[cat] Els concentrats de plaquetes, com el lisat de plaquetes o el plasma ric en plaquetes, són àmpliament emprats en l’àmbit terapèutic gràcies a la seva contribució en el procés de tancament de ferides o Wound Healing, així com per la seva gran capacitat de regeneració en diversos tipus de teixits. Les limitacions presents a l’hora d’obtenir un producte estàndard, a causa de l’heterogeneïtat dels donats i la falta de mètodes estandarditzats per l’aïllament i conservació, han generat la necessitat de cercar mètodes terapèutics alternatius. En aquest context, van aparèixer els estudis basats en les vesícules extracel·lulars derivades de plaquetes. Aquestes són nanoestructures envoltades per una bicapa lipídica implicades en la comunicació cel·lular. Malgrat la seva eficàcia en el tractament de ferides, encara no s’ha desenvolupat un mètode òptim per a la seva conservació a llarg termini que permeti establir-les en la pràctica clínica habitual. En el present treball s’ha comparat el mètode comú de conservació amb un nou mètode basat en la formulació amb crioprotectors, lioprotectors i surfactants (sucrosa, albúmina i poloxàmer) i la seva posterior liofilització, permetent així una conservació a temperatura ambient, la qual resultaria menys costosa i més pràctica. Les vesícules extracel·lulars van ser aïllades mitjançant cromatografia d’exclusió per tamanys i, posteriorment, van ser caracteritzades mitjançant una anàlisi de seguiment de nanopartícules (NTA), microscòpia electrònica de transmissió (TEM), citometria de flux i Western Blot. Per avaluar la funcionalitat es van realitzar assajos in vitro en fibroblasts gingivals humans immortalitzats (hTERT/hNOF). Malgrat que el mètode de conservació proposat va permetre el manteniment de les propietats de les vesícules extracel·lulars, no es va conservar la seva funcionalitat per al tancament de ferides. Per aquest motiu, suggerim que es duguin a terme nous estudis in vitro de funcionalitat amb tècniques més precises per avaluar aquest possible nou mètode de conservació.

[spa] Los concentrados de plaquetas, como el lisado de plaquetas o el plasma rico en plaquetas, son ampliamente utilizados en el ámbito terapéutico gracias a su contribución en el proceso de cierre de heridas o Wound Healing, así como su gran capacidad de regeneración en distintos tejidos. Las limitaciones presentes a la hora de obtener un producto estándar, debidas a la heterogeneidad de los donantes y la falta de métodos estandarizados para el aislamiento y conservación, han generado la necesidad de buscar métodos terapéuticos alternativos. En este contexto, aparecieron los estudios basados en vesículas extracelulares derivadas de plaquetas. Estas son nanoestructuras rodeadas por una bicapa lipídica implicadas en la comunicación celular. A pesar de su eficacia en el tratamiento de heridas, no se ha desarrollado aún un método óptimo para su conservación a largo plazo que permita establecerlas en la práctica clínica habitual. En el presente trabajo se compara el método habitual de conservación con un nuevo método basado en la formulación con crioprotectores, lioprotectores y surfactantes (sacarosa, albúmina y poloxamero) y su posterior liofilización, permitiéndose así una conservación a temperatura ambiente menos costosa y más práctica. Las vesículas extracelulares fueron aisladas mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y, posteriormente, fueron caracterizadas mediante un análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), microscopía electrónica de transmisión (TEM), citometría de flujo y Western Blot. Para evaluar la funcionalidad se realizaron ensayos in vitro en fibroblastos gingivales humanos inmortalizados (hTERT/hNOF). A pesar de que este método de conservación propuesto permitió el mantenimiento de las propiedades de las vesículas extracelulares, no conservó la funcionalidad de cierre de heridas de éstas. Por ello, sugerimos que se realicen nuevos estudios in vitro de funcionalidad con técnicas más precisas para evaluar este posible nuevo método de conservación.

[eng] Platelet concentrates, like platelet lysate or platelet-rich plasma, are widely used in therapeutics due to their contribution in the wound healing process, and even due to their great regenerative capacity in different tissues. The limitations in obtaining a standard product, due to the high heterogeneity of the donors and the lack of isolation and characterization standardized methods, have generated a need to search for therapeutic alternatives. In this context, studies based on platelet-derived extracellular vesicles have emerged. These are nanostructures surrounded by a lipidic bilayer involved in cellular communication. Despite their efficacy in wound healing, no optimal method for its long-term preservation has been developed to establish them in routine clinical practice. In the present study, the usual conservation method has been compared with a new method based on the formulation with cryoprotectants, lioprotectants and surfactants (sucrose, albumin and poloxamer) and its subsequent lyophilisation, allowing their conservation at room temperature which is less expensive and more practical. Extracellular vesicles have been isolated by size exclusion chromatography and subsequently characterized by nanoparticle tracking analysis (NTA), transmission electron microscopy, flow cytometry and Western Blot. To evaluate their functionality, we have performed in vitro assays with immortalized gingival human fibroblasts (hTERT/hNOF). Despite the proposed method of conservation has allowed to maintain of EV’s properties, it has not preserved their wound healing functionality. For that reason, we suggest the need to make new in vitro functional assays with more precise techniques to evaluate this possible new preservation method.