Role of the complement factor H-related proteins 1 and 3 in Pseudomonas aeruginosa infections

Abstract

[eng] Introduction: Pseudomonas aeruginosa is a leading cause of morbidity and mortality in hospitalized patients with pneumonia or bloodstream infections. The outcome of these infections depends on a wide range of factors, including the intrinsic virulence of the microorganism and its antimicrobial resistance phenotype, as well as the host immune effectors mechanisms. The complement system plays a crucial role in defense against P. aeruginosa infections. This system may directly lyse the bacterial cells, opsonize them to facilitate the recognition by the phagocyte cells, and release anaphylatoxins that promote the phagocyte recruitment and pro-inflammatory state at the site of infection. Notably, this pathogen counteracts complement attack by recruiting Factor H, a complement regulator that inactivates C3b, preventing the formation of the C3 convertase and complement amplification in the bacterial surface. Factor H-related proteins (FHRs) are a group of plasma proteins evolutionarily related to Factor H that have been postulated to interfere with this bacterial evasion mechanism. However, the biological consequences of the interaction of the FHRs with P. aeruginosa are still poorly understood. In this thesis, we aimed to investigate the interaction between FHR-3 and FHR-1 with P. aeruginosa and the biological consequences in the pathogenesis of P. aeruginosa infections. Research content: In the first part of this work, we show that FHR-3 binds to P. aeruginosa in an LPS O-antigen-dependent manner and identify that EF-Tu has a binding region for both Factor H and FHR- 3 located in its N-terminal region. Binding assays with purified components show that purified FHR-3 competes with Factor H for binding to P. aeruginosa. Importantly, we demonstrate that FHR-3 bound to bacterial surface promotes complement-activation, which results in increased opsonization and killing of P. aeruginosa. Our results indicate that FHR-3 is a previously unrecognized protecting host factor to fight P. aeruginosa infections. In the second part, we show that FHR-1 binds to P. aeruginosa via the outer membrane protein OprG in an LPS O-antigen-dependent manner. Binding assays with purified components or with FHR-1 deficient serum supplemented with FHR-1 show that FHR-1 competes with Factor H for binding to P. aeruginosa. Blockage of Factor H binding to C3b deposited on the bacteria reduces Factor H-mediated cofactor activity of C3b degradation, increasing the opsonization of the bacteria and the formation of the potent chemoattractant C5a. Conclusions: Our current work identifies FHR-3 as a novel protecting host factor that enhances complement activation in the bacterial surface and promotes clearance of P. aeruginosa. Therefore, FHR-3 levels in blood may be a host factor that rules susceptibility to P. aeruginosa bloodstream infections. In addition, our findings indicate that FHR-1 is a host factor that modulates the complement activation and its effects on P. aeruginosa infections.

[spa] Introducción: Pseudomonas aeruginosa es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes hospitalizados con neumonía o infecciones del torrente sanguíneo. El resultado de estas infecciones depende de un amplio abanico de factores, entre los que se incluyen la virulencia intrínseca del microorganismo y su fenotipo de resistencia a los agentes antimicrobianos, así como los mecanismos efectores inmunitarios del huésped. El sistema del complemento juega un papel crucial en la defensa contra las infecciones por P. aeruginosa. Este sistema puede lisar directamente las bacterias, opsonizarlas para facilitar el reconocimiento por parte de los fagocitos, y liberar anafilotoxinas que promueven el reclutamiento de fagocitos y el estado pro-inflamatorio en el sitio de la infección. Este patógeno contrarresta el efecto del complemento reclutando Factor H, una proteína reguladora del complemento que inactiva C3b evitando, así, la formación de la C3 convertasa y la amplificación de la cascada del complemento sobre la bacteria. Además, se ha postulado que un grupo de proteínas plasmáticas que evolutivamente están relacionadas con el Factor H, conocidas como proteínas relacionadas con el Factor H (del inglés "Factor H-related", FHR), son capaces de interferir en dicho sistema de evasión bacteriano. Sin embargo, las consecuencias biológicas de la interacción de estas proteínas con P. aeruginosa aún no se conocen bien. El objetivo de esta tesis ha sido investigar las interacciones entre FHR-3 y FHR-1 con P. aeruginosa y las consecuencias biológicas de estas interacciones en la patogénesis de las infecciones causadas por P. aeruginosa. Contenido de la investigación: En la primera parte de este trabajo, demostramos que el antígeno O del LPS modula la unión de FHR-3 a P. aeruginosa e identificamos que la proteína EF-Tu tiene una región de unión tanto para el Factor H como para el FHR-3 localizada en su región N-terminal. Los ensayos de unión con componentes purificados muestran que el FHR-3 purificado compite con el Factor H por la unión a P. aeruginosa. Además, determinamos que la unión de FHR-3 a la superficie bacteriana promueve la activación del complemento, lo que resulta en una mayor opsonización y muerte de P. aeruginosa. Así, nuestros resultados indican que el FHR-3 es un factor del huésped, previamente desconocido, que protege frente a las infecciones causadas por P. aeruginosa. En la segunda parte, determinamos que el FHR-1 se une a P. aeruginosa a través de la proteína de membrana externa OprG. Esta unión está modulada por la longitud del antígeno O del LPS. Los ensayos de unión con componentes purificados o con suero deficiente en FHR-1 complementado con FHR-1 muestran que el FHR-1 compite con el Factor H para unirse a P. aeruginosa. El bloqueo de la unión del Factor H al C3b depositado sobre la bacteria reduce la actividad cofactora de degradación del C3b mediada por el Factor H incrementando, así, la opsonización de la bacteria y la formación del potente quimioatrayente C5a. Conclusiones: Nuestro trabajo identifica al FHR-3 como un nuevo factor protector del huésped que fomenta la activación del complemento en la superficie bacteriana y promueve la eliminación de P. aeruginosa. Por lo tanto, los niveles de FHR-3 en sangre pueden ser un factor del huésped que Resumen 4 determina la susceptibilidad a las infecciones del torrente sanguíneo causadas por P. aeruginosa. Además, nuestros descubrimientos indican que el FHR-1 es un factor del huésped que modula la activación del sistema del complemento y sus efectos en las infecciones por P. aeruginosa.

[cat] Introducció: Pseudomonas aeruginosa és una de les principals causes de morbiditat i mortalitat en pacients hospitalitzats amb pneumònia o infeccions del torrent sanguini. El resultat d’aquestes infeccions depèn d’una àmplia gamma de factors, entre els quals s’inclouen la virulència intrínseca del microorganisme i el seu fenotip de resistència als agents antimicrobians, així com els mecanismes efectors immunitaris de l’hoste. El sistema del complement juga un paper crucial en la defensa contra les infeccions per P. aeruginosa. Aquest sistema pot llisar directament els bacteris, opsonitzar-los facilitant el reconeixement per part dels fagòcits, i alliberar anafilotoxines que afavoreixen el reclutament de fagòcits i l'estat pro-inflamatori en el lloc de la infecció. Aquest patogen contraresta l’atac del complement reclutant el Factor H, una proteïna reguladora del complement que inactiva C3b evitant, així, la formació de la C3 convertasa i l’amplificació de la cascada del complement sobre el bacteri. D'altre banda, s’ha postulat que un grup de proteïnes plasmàtiques relacionades evolutivament amb el Factor H conegudes com les proteïnes relacionades amb el Factor H (de l’anglès "Factor Hrelated", FHR), són capaces d’interferir amb aquest mecanisme d’evasió bacterià. No obstant això, les conseqüències biològiques de la interacció d'aquestes proteïnes amb P. aeruginosa encara no es coneixen bé. L' objectiu d'aquesta tesi va ser investigar les interaccions entre l’FHR-3 i l’FHR-1 amb P. aeruginosa, així com les conseqüències biològiques d'aquestes interaccions en la patogènesi de les infeccions causades per P. aeruginosa. Contingut de la investigació: A la primera part d’aquest treball, demostrem que l'antigen O del LPS modula la unió de l'FHR-3 a P. aeruginosa i identifiquem que la proteïna EF-Tu té una regió d’unió tant pel Factor H com per l'FHR-3 ubicada a la seva regió N-terminal. Els assajos d’unió amb components purificats mostren que l’FHR-3 purificat competeix amb el Factor H per a la unió a P. aeruginosa. A més, vam determinar que la unió del FHR-3 a la superfície bacteriana promou l’activació del sistema del complement, el que resulta en una major opsonització i mort de P. aeruginosa. Els nostres resultats indiquen que l’FHR-3 és un factor protector de l’hoste, no reconegut prèviament, per a combatre les infeccions del torrent sanguini causades per P. aeruginosa. A la segona part, demostrem que l’FHR-1 s’uneix a P. aeruginosa a través de la proteïna de membrana externa OprG. Aquesta unió està modulada per l’antigen O del LPS. Els assajos d’unió amb components purificats o amb sèrum deficient en FHR-1 complementat amb FHR-1 mostren que l’FHR- 1 competeix amb el Factor H per a la unió a P. aeruginosa. El bloqueig de la unió del Factor H al C3b dipositat en els bacteris, redueix l’activitat cofactora de degradació del C3b característica del Factor H, augmentant, així, l'opsonització dels bacteris i la formació del potent quimioatraient C5a. Conclusions: El nostre treball identifica l’FHR-3 com un nou factor protector de l’hoste que reforça l’activació del complement en la superfície bacteriana i promou l’eliminació de P. aeruginosa. Per tant, els nivells de FHR-3 en sang poden ser un factor de l’hoste que determina la susceptibilitat a les infeccions del torrent sanguini causades per P. aeruginosa. A més, els nostres descobriments indiquen que l’FHR-1 és un factor de l’hoste que modula l’activació del complement i els seus efectes sobre les infeccions causades per P. aeruginosa.