Avaluació de cromatografía d'exclusió molecular per a la identificació de biomarcadors de colangiocarcinoma continguts en vesícules extracel.lulars

Abstract

[cat] El colangiocarcinoma (CCA) és el segon tipus de patologia hepàtica més freqüent, encara que manca de tècniques i biomarcadors per a un diagnòstic precoç. Els tumors secreten vesícules extracel·lulars (VEs) al microambient tumoral, afavorint-ne el seu desenvolupament. Per altra banda, l’aspirat biliar és una mostra rarament emprada que s’obté durant la colangioscòpia; degut a la seva proximitat al tumor, es pot aconseguir una mostra líquida enriquida en VEs provinents d’aquest. Aquesta investigació té com a objectiu optimitzar el mètode de cromatografia d’exclusió molecular (SEC) per aïllar VEs a partir de mostres biològiques, amb la finalitat d’analitzar-ne el rendiment i la puresa en comparació amb altres mètodes, per identificar biomarcadors de CCA i facilitar-ne el diagnòstic. En aquest estudi hem aconseguit aïllar VEs d’aspirat biliar mitjançant SEC, i han estat posteriorment caracteritzades per Slot blot per detecció de les tetraspanines CD9 i CD63. La concentració de VEs ha estat determinada per anàlisi de seguiment de nanopartícules (NTA). Es van aïllar RNA i proteïnes procedents de les VEs; encara que no es va recuperar RNA en concentracions i condicions òptimes, la quantitat de proteïna ha estat suficient per a poder realitzar posteriorment estudis de proteòmica. Aquests resultats indiquen que les mostres d’aspirat biliar poden ser útils per a estudiar el CCA i podrien constituir una font de biomarcadors per al diagnòstic i seguiment d’aquesta patologia

[spa] El colangiocarcinoma (CCA) es el segundo tipo de patología hepática más frecuente, aunque carece de técnicas y biomarcadores para un diagnóstico precoz. Los tumores secretan vesículas extracelulares (VEs) al microambiente tumoral, favoreciendo su desarrollo. Por otro lado, el aspirado biliar es una muestra raramente usada que se obtiene durante la colangioscopia; debido a su proximidad al tumor, se puede conseguir una muestra líquida enriquecida en VEs provenientes de este. Esta investigación tiene como objetivo optimizar el método de cromatografía de exclusión molecular (SEC) para aislar VEs a partir de muestras biológicas, con el fin de analizar su rendimiento y pureza en comparación con otros métodos, para identificar biomarcadores de CCA y facilitar su diagnóstico. En este estudio hemos conseguido aislar VEs de aspirado biliar mediante SEC, y han sido posteriormente caracterizadas por Slot blot por detección de las tetraspaninas CD9 y CD63. La concentración de VEs ha sido determinada por análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Se han aislado RNA y proteínas procedentes de las VEs; aunque no se ha recuperado RNA en concentraciones y condiciones óptimas, la cantidad de proteína ha sido suficiente para poder realizar posteriormente estudios de proteómica. Estos resultados indican que las muestras de aspirado biliar pueden ser útiles para estudiar el CCA y podrían constituir una fuente de biomarcadores para el diagnóstico y seguimiento de esta patología

[eng] Cholangiocarcinoma (CCA) is the second most common type of liver pathology, though it lacks techniques and biomarkers for early diagnosis. Tumors secrete extracellular vesicles (EVs) into the tumor microenvironment, promoting their development. On the other hand, bile aspirate is a rarely used sample obtained during cholangioscopy; due to its proximity to the tumor, it can provide a liquid sample enriched with EVs from the tumor. This research aims to optimize the method of size-exclusion chromatography (SEC) to isolate EVs from biological samples, with the purpose of analyzing their yield and purity compared to other methods, to identify CCA biomarkers and facilitate its diagnosis. In this study, we successfully isolated EVs from bile aspirate using SEC, and they were subsequently characterized by Slot blot for the detection of tetraspanins CD9 and CD63. The concentration of EVs was determined by nanoparticle tracking analysis (NTA). RNA and proteins were isolated from the EVs; although RNA was not recovered in optimal concentrations and conditions, the amount of protein was sufficient to subsequently perform proteomic studies. These results indicate that bile aspirate samples can be useful for studying CCA and may constitute a source of biomarkers for the diagnosis and monitoring of this pathology