Polyaminosquaramides (PASQUA) as gene delivery vehicles and cell labelling agents

Abstract

[eng] The use of squaramides in the field of biological and supramolecular chemistry includes significant applications such as powerful anion transporters or fluorescent probes. Their widespread use is primarily due to their synthetic accessibility and their ability to establish intermolecular interactions, particularly hydrogen bonds. However, the incorporation of squaramides in polymers is not as common, and the application of polysquaramides in biological chemistry has not been described to date. The use of cationic polymers in the field of gene delivery as substitutes for viral vectors is gaining importance due to advantages such as greater scalability, the capability to transport nucleic acids without size limitations, and the absence of immune responses. In this context, the ability of squaramides to establish intermolecular interactions with anions, combined with their potential to synthesise polymers, makes them ideal candidates for the development of polysquaramides with applications in nucleic-acid delivery. This thesis, titled “Polyaminosquaramides (PASQUA) as Gene Delivery Vehicles and Cell Labelling Agents”, explores the synthesis and characterisation of a family of polysquaramides, as well as their subsequent evaluation as gene delivery vehicles. This along with its antecedents from the doctoral thesis of PhD Francisca Orvay, represents the first example of polysquaramides applied to nucleic-acid transport and to the field of biological chemistry in general. The thesis is divided into eight chapters, with the synthesised polymers grouped into subfamilies based on their structural similarities. The first chapter introduces fundamental concepts of polymer chemistry, gene therapy, and nucleic acid delivery, highlighting the applicability of certain polymers in these fields. It also provides details on the structures and key advantages of the main polymers currently used for nucleic acid delivery. Additionally, the chapter introduces the "squaramide" unit, discussing its applications across various fields and its role in polymer formation. Finally, it reviews the key contributions of the research group to the study of squaramides, with a special focus on the results obtained by Francisca Orvay in her doctoral thesis, entitled “Synthesis and characterisation of polyaminosquaramides: aggregation studies and biological activity” This earlier work introduced PASQUA polymer (polyaminosquaramide) for the first time. The second chapter outlines the main objectives of this doctoral thesis, which are developed in detail between Chapters Three and Six. Each of these chapters includes its motivation and objectives, the experimental results and discussion, conclusions, and the corresponding experimental section. Chapter Three describes the optimisation process for the synthesis and purification of PASQUA, resulting in a new material with enhanced performance, designated as PASQUA+. Additionally, it includes the validation of the material evaluating its interaction with nucleic acids and its capability as a transfection agent for transporting plasmids of different sizes and morphologies. Chapter Four focuses on the design of various polyoxyethyleneaminosquaramides and their evaluation as transfection agents to study how reducing the number of ionisable nitrogen atoms in the repeating unit affects transfection efficiency. Chapter Five describes the synthesis of new polyaminosquaramides modified with primary amino groups throughout their structure. This strategy increases the number of ionisable nitrogen atoms in the repeating unit and offers the possibility of functionalising the resulting polymers through post-polymerisation reactions. As with the previous chapters, the biological evaluation of the synthesised polymers is also included. Chapter Six centres on the synthesis of fluorescent polyaminosquaramides through the conjugation of fluorophores to the modified polyaminosquaramides with primary amino groups described in Chapter Five. Alongside their synthesis and characterisation, this chapter explores their application as transfection agents and cell-labelling tools. Finally, Chapters Seven and Eight compile the general conclusions and bibliography, respectively.

[cat] L’ús d’esquaramides en el camp de la química biològica i supramolecular ha donat lloc a aplicacions tan significatives com el desenvolupament de potents transportadors d’anions o sondes fluorescents. La seva àmplia utilització es deu principalment a la seva accessibilitat sintètica i a la capacitat que tenen per establir interaccions intermoleculars, especialment enllaços d’hidrogen. No obstant, la incorporació d’esquaramides en polímers no està tan estesa i l’aplicació de poliesquaramides en química biològica no s’ha descrit a dia d’avui. La utilització de polímers catiònics en el transport d’àcids nucleics com a substituts d’agents de transfecció virals està guanyant cada vegada més importància a causa dels avantatges que suposa, com una major escalabilitat, la capacitat de transportar àcids nucleics sense limitacions de mida i el fet que no genera respostes immunològiques. En aquest context, la capacitat d’establir interaccions intermoleculars com anions juntament amb el potencial per a formar polímers, posiciona a les esquaramides com a candidats ideals per al desenvolupament de poliesquaramides amb aplicacions en el camp del transport d’àcids nucleics. D’aquesta manera, la present tesi doctoral titulada “Polyaminosquaramides (PASQUA) as gene delivery vehicles and cell labelling agents” descriu la síntesi i caracterització d’una família de poliesquaramides, així com la seva posterior avaluació com a vehicles per al transport d’àcids nucleics. Aquest treball, juntament amb els antecedents del mateix recollits en la tesi doctoral de la Dra. Francisca Orvay, realitzada en el mateix grup de recerca; representen el primer exemple de poliesquaramides aplicades al transport d’àcids nucleics i, en general al camp de la química biològica. La tesi es divideix en vuit capítols on la descripció dels polímers sintetitzats s’agrupa en subfamílies a causa del seu parentesc estructural. El primer capítol introdueix conceptes fonamentals de química de polímers, així com de teràpia gènica i transport d’àcids nucleics, destacant l’aplicabilitat d’alguns polímers en aquest camp. A més, es presenten les estructures i els avantatges més significatius dels polímers més utilitzats en transport d’àcids nucleics i es presenta el nucli “esquaramida” i les seves aplicacions en diversos camps i en la formació de polímers. Finalment, es presenten les principals contribucions del grup d’investigació en l’aplicació de les esquaramides a la química biològica i en especial, un resum dels resultats obtinguts per part de la Dra. Francisca Orvay en la seva tesi doctoral titulada “Síntesis y caracterización de poliaminoescuaramidas: estudios de agregación y actividad biológica” on es presentà per primera vegada el polímer PASQUA (polyaminosquaramide). El segon capítol descriu els principals objectius d’aquesta tesi doctoral, els quals es desenvolupen en detall entre el tercer i sisè capítol. Cada un d’aquests capítols inclou la motivació i objectius específics, la discussió de resultats obtinguts, les conclusions i la corresponent part experimental. El tercer capítol detalla el procés d’optimització de la síntesi i purificació de PASQUA, donant lloc a un nou material amb millors propietats designat com PASQUA+. Així mateix, inclou la validació del nou material avaluant la seva interacció amb àcids nucleics i la seva capacitat com agent de transfecció en el transport de plàsmids de diferent mida i morfologies. El quart capítol es centra en el disseny de vàries polioxietilenaminoesquaramides i la seva posterior avaluació com agents de transfecció per estudiar com afecta a l’eficiència de transfecció la reducció de nitrògens en la unitat de repetició. El cinquè capítol descriu la síntesi de noves poliaminoesquaramides modificades amb grups amina primaris al llarg de la seva estructura. Aquesta estratègia permet l’augment de nitrògens ionitzables en la unitat de repetició a més d’oferir la possibilitat de funcionalitzar els polímers resultants mitjançant reaccions de post-polimerització. Com en els casos anteriors, també s’inclou l’avaluació de la capacitat de transfecció dels diferents polímers sintetitzats. El sisè capítol aborda la síntesi de poliaminoesquaramides fluorescents mitjançant la conjugació de fluoròfors a les poliaminoesquaramides modificades amb grups amina primaris descrites en el capítol cinc. Juntament amb la síntesi i caracterització, es descriu la seva aplicació com a agents de transfecció i marcatge cel·lulars. Finalment, els capítols set i vuit es corresponen amb les conclusions generals i la bibliografia, respectivament.

[spa] El uso de escuaramidas en el campo de la química biológica y supramolecular ha dado luegar a aplicaciones tan significativas como el desarrollo de potentes transportadores de aniones o sondas fluorescentes. Su amplio uso se debe principalmente a su accesibilidad sintética y a la capacidad que tienen para establecer interacciones intermoleculares, especialmente enlaces de hidrógeno. Sin embargo, la incorporación de escuaramidas en polímeros no está tan extendida y la aplicación de poliescuaramidas en química biológica no se ha descrito hasta la fecha. El empleo de polímeros catiónicos en el transporte de ácidos nucleicos como sustitutos de agentes virales está ganando cada vez más importancia debido a las ventajas que supone, como una mayor escalabilidad, la capacidad de transportar ácidos nucleicos sin límite de tamaño y la ausencia de respuestas inmunes. En este contexto, la capacidad de establecer interacciones intermoleculares con aniones junto con su potencial para formar polímeros, posiciona a las escuaramidas como candidatas ideales para el desarrollo de poliescuaramidas con aplicaciones en el campo del transporte de ácidos nucleicos. Así pues, la presente tesis titulada Polyaminosquaramides (PASQUA) as gene delivery vehicles and cell labelling agents describe la síntesis y caracterización de una familia de poliescuaramidas, así como su posterior evaluación como vehículos para el transporte de ácidos nucleicos. Este trabajo, junto con los antecedentes del mismo recogidos en la tesis doctoral de la Dra. Francisca Orvay, realizada en el seno del mismo grupo de investigación, representa el primer ejemplo de poliescuaramidas aplicadas al transporte de ácidos nucleicos y, en general, al campo de la química biológica. La tesis se divide en ocho capítulos donde la descripción de los polímeros sintetizados se agrupa en subfamilias debido a su parentesco estructural. El primer capítulo introduce conceptos fundamentales de química de polímeros, así como de terapia génica y transporte de ácidos nucleicos, destacando la aplicabilidad que tienen algunos polímeros en este campo. Además, se presentan las estructuras y principales ventajas de los polímeros más utilizados en transporte de ácidos nucleicos, así como el núcleo “escuaramida” y sus aplicaciones en diversos ámbitos incluyendo la formación de polímeros. Finalmente, se recogen las principales contribuciones del grupo de investigación en el estudio de las escuaramidas. con un resumen de los resultados obtenidos por parte de la Dra. Francisca Orvay en su tesis doctoral titulada “Síntesis y caracterización de poliaminoescuaramidas: estudios de agregación y actividad biológica” en la que se presentó por primera vez el polímero PASQUA (polyaminosquaramide). El segundo capítulo describe los principales objetivos de esta tesis doctoral, los cuales se desarrollan en detalle entre el tercer y sexto capítulos. Cada uno de estos capítulos incluye la motivación y objetivos específicos, la discusión de los resultados obtenidos, sus conclusiones, y la correspondiente parte experimental. El tercer capítulo detalla el proceso de optimización de la síntesis y purificación de PASQUA, dando lugar a un nuevo material con mejores propiedades designado como PASQUA+. Asimismo, incluye la validación del material evaluando su interacción con ácidos nucleicos y su capacidad como agende de transfección en el transporte de plásmidos de diferente tamaño y morfologías. El cuarto capítulo se centra en el diseño de varias polioxietilenaminoescuaramidas y su evaluación como agentes de transfección para estudiar cómo afecta a la eficiencia de transfección la reducción de nitrógenos en la unidad de repetición. El quinto capítulo describe la síntesis de nuevas poliaminoescuaramidas modificadas con grupos amino primarios a lo largo de su estructura. Esta estrategia permite el aumento de nitrógenos ionizables en la unidad de repetición además de ofrecer la posibilidad de funcionalizar los polímeros resultantes mediante reacciones de post-polimerización. Como en los casos anteriores, también se incluye la evaluación biológica de los diferentes polímeros sintetizados. El sexto capítulo aborda la síntesis de poliaminosescuaramidas fluorescentes mediante la conjugación de fluoróforos a las poliaminoescuaramidas modificadas con grupos amino primarios descritas en el capítulo cinco. Además de su síntesis y caracterización, se explora su aplicación como agentes de transfección y marcaje celulares. Finalmente, los capítulos siete y ocho agrupan las conclusiones generales y la bibliografía, respectivamente.