Understanding the regulation of plant primary metabolism by integrating metabolomics and physiological approaches

Abstract

[spa] En los últimos años, la investigación de la regulación metabólica de las plantas ha avanzado notablemente gracias a la metabolómica, especialmente con el desarrollo del 13C-análisis de flujo metabólico (13C-MFA). A pesar de los avances significativos, el mapeo preciso de los patrones de flujo metabólico in vivo sigue siendo un desafío. Mientras que los enfoques basados en la resonancia magnética nuclear han resuelto redes pequeñas con gran precisión, los métodos de espectrometría de masas se han visto obstaculizados por la falta de información posicional a nivel atómico. Esta Tesis aborda esta limitación mediante un nuevo enfoque que utiliza cromatografía de gases (GC) acoplada a la espectrometría de masas (MS) para determinar con precisión el marcado 13C-posicional en metabolitos clave del metabolismo central. Este enfoque, validado con sustancias de referencia marcadas posicionalmente con 13C vía GC-impacto electrónico-MS y GC-ionización química a presión atmosférica-MS, ha demostrado eficacia en el análisis de datos previos de 13C-MFA en hojas y células guardas. Se ha obtenido información novedosa sobre la glucosa, revelando que sus átomos de carbono son preferentemente marcados por la fotosíntesis y la gluconeogénesis. Además, se ha establecido una plataforma para investigar la incorporación de 13C en malato y glutamato derivados de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPc). Nuestros resultados revelaron que la gluconeogénesis y la asimilación de CO2 mediada por PEPc en malato se activan de manera independiente a la luz en las células guardas, mientras que los flujos de glucólisis y PEPc hacia el glutamato están restringidos por el sistema de tiorredoxina mitocondrial en hojas iluminadas. También exploramos la dinámica metabólica de las células guardas, después de la asimilación de CO2 mediada por PEPc, tanto en la oscuridad como durante la transición de la oscuridad a la luz. Aunque los cambios metabólicos fueron mayormente consistentes en general, se evidenció la influencia de la luz en las estructuras de la red metabólica, resultando en un aumento del enriquecimiento de 13C en azúcares y metabolitos asociados al ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Además, dado que el cambio climático está afectando el rendimiento de las plantas en todo el mundo, también investigamos los efectos de la sequía, altas temperaturas y alta concentración de CO2 en un helecho (Nephrolepis exaltata) y una angiosperma típica, Brassica oleracea. Mientras que B. oleracea mostró respuestas fisiológicas significativas a la alta concentración de CO2, independientemente de otras condiciones de estrés, el helecho exhibió una respuesta limitada a todos los estreses a nivel fisiológico. Los niveles de lípidos y metabolitos primarios en B. oleracea cambiaron inducidos por estrés, lo que no sucedió en el helecho. Nuestros hallazgos sugieren impactos diferenciales del cambio climático en helechos y angiospermas. En resumen, la integración de análisis metabolómicos y fisiológicos proporciona una visión detallada de los mecanismos subyacentes a la regulación y adaptación metabólica de las plantas. Este enfoque no solo ofrece estrategias innovadoras para el análisis metabolómico, sino que también contribuye al entendimiento de las respuestas ambientales de las plantas, de diferentes grupos, en un mundo en constante cambio climático.

[cat] En els darrers anys, la recerca sobre la regulació metabòlica de les plantes ha avançat notablement gràcies a la metabolòmica, especialment amb el desenvolupament de l'anàlisi de flux metabòlic amb carboni-13 (13C-MFA). Malgrat els avenços significatius, el mapeig precís dels patrons de flux metabòlic in vivo continua sent un repte. Mentre que els enfocaments basats en la resonància magnètica nuclear han resolt xarxes petites amb gran precisió, els mètodes d'espectrometria de masses s'han vist obstaculitzats per la manca d'informació posicional a nivell atòmic. Aquesta tesi aborda aquesta limitació mitjançant un nou enfocament que utilitza la cromatografia de gasos (GC) acoblada a l'espectrometria de masses (MS) per determinar amb precisió el marcatge 13C-posicional en metabòlits clau del metabolisme central. Aquest enfocament, validat amb substàncies de referència marcades posicionalment amb 13C via GC-impacte electrònic-MS i GC-ionització química a pressió atmosfèrica-MS, ha demostrat eficàcia en l'anàlisi de dades prèvies de 13C-MFA en fulles i cèl·lules guarda. S'ha obtingut informació nova sobre la glucosa, revelant que els seus àtoms de carboni són preferentment marcats per la fotosíntesi i la gluconeogènesi. A més, s'ha establert una plataforma per investigar la incorporació de 13C en malat i glutamat derivats de l'enzim fosfoenolpiruvat carboxilasa (PEPc). Els nostres resultats van revelar que la gluconeogènesi i l'assimilació de CO2 mediada per PEPc en malat s'activen de manera independent a la llum a les cèl·lules guarda, mentre que els fluxos de glucòlisi i PEPc cap al glutamat estan restringits pel sistema de tiorredoxina mitocondrial en fulles il·luminades. També vam explorar la dinàmica metabòlica de les cèl·lules guarda, després de l'assimilació de CO2 mitjançant per PEPc, tant a la foscor com durant la transició de la foscor a la llum. Tot i que els canvis metabòlics van ser majoritàriament consistents en general, es va evidenciar la influència de la llum en les estructures de la xarxa metabòlica, resultat en un augment de l'enriquiment de 13C en sucres i metabòlits associats al cicle de l'àcid tricarboxílic (TCA). A més, donat que el canvi climàtic està afectant el rendiment de les plantes a tot el món, també vam investigar els efectes de la sequera, altes temperatures i alta concentració de CO2 en una falguera (Nephrolepis exaltata) i una angiosperma típica, Brassica oleracea. Mentre que B. oleracea va mostrar respostes fisiològiques significatives a la alta concentració de CO2, independentment d'altres condicions d'estrès, la falguera va exhibir una resposta limitada a tots els estressos a nivell fisiològic. Els nivells de lípids i metabòlits primaris a B. oleracea van canviar induïts per estrès, cosa que no va succeir a la falguera. Els nostres resultats suggereixen impactes diferencials del canvi climàtic en falgueres i angiospermes. En resum, la integració d'anàlisis metabolòmiques i fisiològiques proporciona una visió detallada dels mecanismes subjacents a la regulació i adaptació metabòlica de les plantes. Aquest enfocament no només ofereix estratègies innovadores per a l'anàlisi metabolòmica, sinó que també contribueix a la comprensió de les respostes ambientals de les plantes, de diferents grups, en un món en constant canvi climàtic.

[eng] In recent years, research on the plant metabolic regulation has significantly advanced thanks to metabolomics, mainly by the emergence of 13C-metabolic flux analysis (13C-MFA), which is revealing complex network patterns of metabolic pathways. Despite significant progress, accurately mapping patterns of in vivo metabolic flux remains challenging. While approaches based on nuclear magnetic resonance have resolved small networks with high accuracy, mass spectrometry methods have been hindered by the lack of atomic-level positional information. This Thesis addresses this limitation through an establishment of a novel approach using gas chromatography (GC) coupled with mass spectrometry (MS) to precisely determine 13C-positional labeling in key metabolites of central metabolism. Validated with reference substances positionally labeled with 13C via GC-electron impact-MS and GC-atmospheric pressure chemical ionization-MS, this approach showcases efficacy in analyzing previous 13C-MFA data in leaves and guard cells. New insights were obtained into glucose, which has carbon atoms preferentially labeled by photosynthesis and gluconeogenesis. Additionally, we provide a platform to investigate 13C-incorporation into malate and glutamate derived from phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPc). Our findings revealed that gluconeogenesis and PEPc-mediated CO2 assimilation into malate are activated in a light-independent manner in guard cells, while fluxes from glycolysis and PEPc towards glutamate are restricted by the mitochondrial thioredoxin system in illuminated leaves. We also explored the metabolic dynamics of guard cells after PEPc-mediated CO2 assimilation, under darkness or during dark-to-light transition. Although metabolic changes were largely consistent between dark-exposed and illuminated guard cells, the influence of light on metabolic network structures was evidenced by increased 13C-enrichment in sugars and metabolites associated with the tricarboxylic acid (TCA) cycle. Additionally, given the impact of climate change on plants performance worldwide, we investigated the effects of drought, high temperatures, and high CO2 concentration on a fern (Nephrolepis exaltata) and a typical angiosperm, Brassica oleracea. While B. oleracea exhibited significant physiological responses to high CO2 concentration, independent of other stress conditions, the fern was mostly unresponsive to all stresses at the physiological level. Lipid and primary metabolite levels in B. oleracea changed in response to stress, whereas these metabolic responses were absent in the fern. Our findings suggest differential impacts of climate change on ferns and angiosperms. Collectively, the integration of metabolomics and physiological analyses used in our studies provides comprehensive insights into mechanisms underlying plant metabolic regulation and adaptation, offering innovative strategies for metabolomics analysis and contributing to knowledge of the environmental responses of plants, from different groups, to the conditions of a world undergoing climate change.

[por] Nos últimos anos, a pesquisa sobre a regulação metabólica das plantas avançou consideravelmente graças à metabolômica, especialmente com o desenvolvimento da 13C-análise de fluxo metabólico (13C-MFA). Apesar dos avanços significativos, o mapeamento preciso dos padrões de fluxo metabólico in vivo ainda é um desafio. Enquanto as abordagens baseadas em ressonância magnética nuclear elucidaram redes metabólicas pequenas com grande precisão, os métodos com espectrometria de massas foram prejudicados pela falta de informação posicional a nível atômico. Esta Tese aborda essa limitação através de uma nova abordagem que utiliza cromatografia gasosa (GC) acoplada à espectrometria de massas (MS) para determinar com precisão a marcação 13C-posicional em metabólitos chave do metabolismo central. Esta abordagem, validada com substâncias de referência marcadas posicionalmente com 13C via GC-impacto eletrônico-MS e GC-ionização química a pressão atmosférica-MS, demonstrou eficácia na análise de dados prévios de 13C-MFA em folhas e células-guarda. Novas informações foram obtidas sobre a glicose, revelando que seus átomos de carbono são preferencialmente marcados pela fotossíntese e gliconeogênese. Além disso, foi estabelecida uma plataforma para investigar a incorporação de 13C em malato e glutamato derivados da enzima fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPc). Nossos resultados revelaram que a gliconeogênese e a assimilação de CO2 mediada por PEPc em malato são ativadas de maneira independente à luz nas células-guarda, enquanto que os fluxos de glicólise e PEPc em direção ao glutamato são restringidos pelo sistema de tiorredoxina mitocondrial em folhas iluminadas. Também exploramos a dinâmica metabólica das células-guarda após a assimilação de CO2 mediada por PEPc, tanto no escuro quanto durante a transição do escuro para a luz. Embora as mudanças metabólicas tenham sido consistentes de modo geral, a influência da luz nas estruturas da rede metabólica foi evidente, resultando em um aumento do enriquecimento de 13C em açúcares e metabólitos associados ao ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Além disso, dada a influência do clima nas plantas em todo o mundo, também investigamos os efeitos da seca, altas temperaturas e alta concentração de CO2 em uma samambaia (Nephrolepis exaltata) e uma angiosperma típica, Brassica oleracea. Enquanto B. oleracea mostrou respostas fisiológicas significativas à alta concentração de CO2, independentemente de outras condições de estresse, N. exaltata exibiu uma resposta limitada a todos os estresses a nível fisiológico. Os níveis de lipídios e metabólitos primários em B. oleracea mudaram em resposta ao estresse, o que não ocorreu na N. exaltata. Nossos resultados sugerem que as mudanças climáticas impactam diferencialmente samambaias e angiospermas. Em resumo, a integração de análises metabolômicas e fisiológicas proporciona uma visão detalhada dos mecanismos subjacentes à regulação e adaptação metabólica das plantas. Estas abordagens não apenas oferecem estratégias inovadoras para a análise metabolômica, mas também contribuem para o entendimento das respostas ambientais das plantas, de diferentes grupos, em um mundo em constante mudança climática.