Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into endothelial cells, pericytes and neural precursor cells (NPCs) to generate 3D models of the neurovascular unit

Abstract

[eng] The blood–brain barrier (BBB) is a tightly regulated structure whose failure amplifies oedema and inflammation after ischaemic stroke, yet most in vitro models rely on animal cells or simple monolayer culture models, limiting clinical insight. Here we establish a defined process that differentiates human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into the three principal cellular constituents of the neurovascular unit (NVU)—endothelial cells (ECs), pericytes and neural precursor cells (NPCs)—to provide all building blocks for advanced 3D BBB models. Stage-specific signalling cues first drive hiPSCs toward mesodermal differentiation; CD34-based magnetic sorting then separates endothelial and pericyte branches, while a SMAD inhibition protocol generates ectodermal NPCs via embryoid body formation. Flow cytometry and confocal analyses were used to characterize the obtained cells. Pluripotent cultures expressed OCT4, SOX2, TRA-1-60 and SSEA-4 at >95%. Mesodermal precursors up-regulated Brachyury to 94,8%. Mature pericytes showed high expression of CD13, CD140b and NG2 (≥96%), whereas ECs displayed strong VE-cadherin (CD144, 86,7%) but only moderate CD31, CD34 and KDR levels, indicating only partial maturation. NPCs exhibited nuclear SOX2 and PAX6 in >90% of cells (SOX2 99,1%, PAX6 94,8%), confirming strong neural commitment. Collectively, the protocol yields promising results, with generally viable cell populations within ten days for mesodermal lineages and four weeks for NPCs. These cells can self-assemble into perfusable, three-dimensional microvessels that recreate BBB structure and permeability, offering a fully human platform to study stroke-induced barrier failure in vitro

[spa] La barrera hematoencefálica (BBB) es una estructura estrechamente regulada cuyo fallo amplifica el edema y la inflamación tras un ictus isquémico; aun así, la mayoría de los modelos in vitro se basan en células animales o en modelos simples de cultivo en monocapa, lo que limita el conocimiento clínico. Aquí establecemos un proceso definido que diferencia células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) en los tres constituyentes celulares principales de la unidad neurovascular (NVU) - células endoteliales (ECs), pericitos y células precursoras neurales (NPCs) - para proporcionar todos los bloques de construcción para modelos 3D avanzados de la BBB. Las señales específicas de cada etapa primero conducen a las hiPSC hacia la diferenciación mesodérmica; a continuación, la clasificación magnética basada en la expresión de CD34 separa la rama de células endoteliales y de los pericitos, mientras que un protocolo de inhibición de SMAD genera NPCs de vía ectodérmica a partir de hiPSCs mediante la formación de cuerpos embrioides. Se utilizaron citometría de flujo y 7 análisis confocal para caracterizar las células obtenidas. Los cultivos pluripotentes expresaron OCT4, SOX2, TRA-1-60 y SSEA-4 en >95%. Los precursores mesodérmicos presentaban expresión elevada de Brachyury al 94,8%. Los pericitos maduros mostraban una expresión alta de CD13, CD140b y NG2 (≥96%), mientras que las ECs mostraban una fuerte expresión de VE-cadherina (CD144, 86,7%) pero sólo niveles moderados de CD31, CD34 y KDR, lo que indica sólo una maduración parcial. Las NPCs presentaban SOX2 y PAX6 nuclear en >90% de las células (SOX2 99,1%, PAX6 94,8%), lo que confirma un fuerte compromiso neural. En conjunto, el protocolo arroja resultados prometedores, con poblaciones celulares generalmente viables en un plazo de diez días para las células de estirpe mesodérmico y de cuatro semanas para las NPCs. Estas células pueden autoensamblarse en microvasos tridimensionales perfundibles que recrean la estructura y permeabilidad de la BBB, ofreciendo una plataforma totalmente humana para estudiar in vitro el fallo de barrera inducido por el ictus