Effect of diet and cold exposure in the remodeling of white into brown adipose tissue and its implications in obesity

Abstract

[eng] Actual strategies to combat obesity are not fully efficient and imply a financial challenge for public healthcare. In the last few years, due to the rediscovery of inducible brown adipose tissue (BAT) in adult humans, the study of this energy-dissipating tissue has emerged as an active area of research to try to counteract obesity. The central aim of the present PhD thesis was to go in depth regarding the effects of diet and cold exposure on remodeling of white into BAT (browning process), using rats as the main animal model. We have analysed the ability to induce browning of different type of diets: rich in fats (such as the highly palatable cafeteria diet or commercial high-fat diets with different fat content) or rich in proteins. We have also analysed the browning effect of cold exposure at different ages of rat development. Increased fat intake is a major cause of obesity, since the excess of calories is accumulated as fat in adipose tissue. High-fat (HF) diets are known to increase BAT recruitment and UCP1 levels in an attempt to counteract increased adiposity. Additionally, our results show that chronic intake of hyperlipidic diets, especially when administered ad libitum (hypercaloric vs isocaloric) and with higher fat proportion, can induce the acquisition of brown-like features in WAT in a depot-specific manner, with the inguinal and retroperitoneal depot being those with a higher browning capacity. These diets, mainly the cafeteria diet, are able to induce a brown/brite profile in WAT by increasing mRNA expression of key browning markers. This higher browning capacity is translated into the morphological appearance of UCP1-expressing brown-like (brite) adipocytes in the retroperitoneal depot, which appears to be particularly sensitive to browning. Reversion of the cafeteria to a control diet restored most of the changes observed at the molecular and morphological level. Moreover, we focused our attention on the WAT depot surrounding the interscapular BAT, the isWAT, which has been poorly studied. We have described that this depot possesses a molecular profile that evidences a white adipose nature but shares characteristics of BAT and presents a higher browning capacity in response to the intake of a cafeteria HF diet in comparison to other WAT depots. Thus, isWAT appears as an interesting depot to be considered in thermogenic research, as it could be significantly contributing to energy balance. In addition to fat, dietary protein content is also known to have an effect on body weight balance, and high-protein (HP) diets are increasingly being used for weight-loss purposes. It has been reported that HP diets could increase BAT thermogenesis, however, results are controversial. We analysed the effect of chronic administration of a casein-based HP diet, and did not find any relevant signs of BAT activation or white to BAT remodeling either at the molecular or morphological level in the different depots analysed that could be contributing to the lower body weight of our animals. Discrepancy with other authors makes evident the importance of the amount and source of proteins used. Cold exposure is the strongest thermogenic stimulus which, in addition to activate BAT function, can induce the appearance of brite adipocytes in WAT. It is known that cold response in BAT is higher in younger animals. In this thesis, we have demonstrated that WAT browning in response to cold is also age-dependent; cold exposure increased Ucp1 mRNA expression, both in BAT and in the studied WAT (retroperitoneal), but only in one-month-old rats. Other brown/brite markers were also affected in WAT, also at this early age, and this increased thermogenic capacity was translated into the appearance of a high number of brown-like adipocytes positive for UCP1 and for the brown-adipocyte marker CIDE-A. Besides our studies in adipose tissue, as an innovative approach, we analysed the potential usefulness of gene expression analysis in a set of blood cells (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) to perform BAT-related studies. Our results indicate that PBMC can reflect some of the regulatory patterns observed in BAT and WAT in response to the intake of HF diets, as well as browning response to cold exposure. Thus, PBMC could be used as an easily obtainable source of brown/brite biomarkers, very useful to carry out human studies with minimum invasiveness. Finally, other than its important role in body weight maintenance, BAT function is also related to regulation of insulin sensitivity. As part of a collaborative study inside the European DIABAT project, we have set up experimental conditions to perform an in vitro conditioned system between brown/brite adipocytes and pancreatic cells that can be a useful tool to go in depth in the understanding of the interconnection between BAT and pancreas. Moreover, we present preliminary results that show an influence of BAT-derived adipokines controlling insulin secretion in cultured pancreatic beta cells. All in all, the results from this thesis provide evidence that hyperlipidic diets, especially when administered ad libitum and with higher fat proportion, produce an impact on gene expression profile of browning markers in WAT, which is indicative of a greater capacity to convert into BAT. Also, we contributed to characterise the effect of cold exposure on WAT browning process, which is important especially in younger animals. Although it is difficult to know the physiological relevance in energy balance of increased browning potential observed in our studies, research on factors/conditions capable of remodeling WAT into BAT, the molecular mechanisms which are involved in this process and its control, is crucial in understanding energy balance regulation and can help in the battle against obesity. Interestingly, increased browning capacity observed at the mRNA level in our studies was always related to a gene expression profile clearly indicative of activation of metabolic pathways associated to fatty acid mobilization and oxidation in the adipose depots analysed. Moreover, we have shown the potential usefulness of a fraction of easily obtainable blood cells, PBMC, to reflect BAT recruitment and WAT browning in response to the studied stimuli; the use of non-invasive biological material will be extremely valuable for future BAT human research.

[spa] Las estrategias actuales para combatir la obesidad no son eficientes e implican un reto financiero para la salud pública. En los últimos años, debido al redescubrimiento de tejido adiposo marrón (TAM) inducible en humanos adultos, el estudio de este tejido disipador de energía se ha convertido en un área con un gran potencial para tratar la obesidad. El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue el de profundizar en el estudio de los efectos de la dieta y de la exposición al frío en la remodelación del tejido adiposo blanco (TAB) a marrón (proceso de marronización), usando ratas como principal modelo animal. Para ello hemos analizado la capacidad de inducir marronización de diferentes tipos de dietas: ricas en grasas (como la dieta de cafetería que ofrece gran palatabilidad o dietas hiperlipídicas comerciales con diferentes contenidos de grasa), o rica en proteínas. También hemos analizado el efecto de la marronización en respuesta al frío a diferentes edades del desarrollo en ratas. El aumento de la ingesta de dietas ricas en grasa es una de las principales causas de la obesidad, ya que el excedente calórico se acumula como grasa en el tejido adiposo. Se sabe que las dietas ricas en grasas (HF) aumentan el recruitment del TAM así como los niveles de UCP1 en un intento por contrarrestar el aumento de adiposidad. Además, nuestros resultados muestran que la ingesta crónica de dietas hiperlipidicas, especialmente cuando es administrada ad libitum (en condiciones hipercalóricas vsisocalóricas) y con una elevada proporción de grasa, puede inducir la aparición de adipocitos con características de adipocitos marrones en TAB de manera específica en los diferentes depósitos grasos, siendo el inguinal y el retroperitoneal los que tienen una mayor capacidad de marronización. Estas dietas, principalmente la dieta de cafetería, son capaces de inducir la aparición de un perfil de adipocitos marrones o adipocitos brite en el TAB, incrementando la expresión de ARNm de marcadores clave de marronización; esta elevada capacidad de marronización se traduce en la aparición a nivel morfológico de adipocitos similares a los marrones (brite) que expresan UCP1, en el depósito retroperitoneal, que parece ser particularmente sensible a la marronización. La reversión de la dieta cafetería a una dieta control restablece muchos de los cambios observados a nivel molecular y morfológico. Por otra parte, nos interesamos en el depósito de TAB que rodea al TAM interescapular, el TABis, que no había sido muy estudiado previamente. Hemos descrito que este tejido presenta un perfil molecular que evidencia una naturaleza de tejido adiposo blanco pero comparte características del TAM y presenta una gran capacidad de marronización en respuesta a la ingesta de una dieta de cafetería en comparación con otros depósitos TAB. Por tanto, el TABis se presenta como un depósito interesante en este tipo de estudios, por lo que debería ser considerado en investigaciones relacionadas con la termogénesis, ya que podría estar contribuyendo significativamente al mantenimiento del balance energético. Además de la grasa, se sabe que el contenido de proteínas en la dieta desempeña un papel importante en la regulación del peso corporal, y las dietas hiperproteicas (HP) están siendo cada vez más usadas en estrategias de pérdida de peso. Se ha propuesto que las dietas HP son capaces de aumentar la termogénesis en el TAM, sin embargo, los resultados son controvertidos. Como parte de esta tesis hemos analizamos el efecto de la administración crónica de una dieta HP rica en caseína, y no hemos encontrado ningún signo relevante que muestre activación del TAM o remodelación de TAB a TAM, ni a nivel molecular ni a nivel morfológico en los diferentes depósitos analizados y que pudiera estar contribuyendo a la pérdida de peso de nuestros animales. Esta discrepancia con otros autores pone en evidencia la importancia de la proporción y del tipo de proteínas utilizadas. La exposición al frío es el estímulo termogénico más fuerte que, además de activar la funcionalidad del TAM, puede inducir la aparición de adipocitos brite en el TAB. Se sabe que la respuesta al frío en el TAM es mayor en animales jóvenes. En esta tesis hemos demostrado que la marronización del TAB en respuesta al frío también es dependiente de la edad; la exposición al frío aumenta la los niveles de ARNm de la Ucp1, tanto en TAM como en el TAB estudiado (depósito retroperitoneal), tan solo en las ratas de un mes de edad. Otros marcadores de adipocitos marrones o adipocitos brite también se vieron afectados a esta edad temprana, y esta capacidad termogénica incrementada se tradujo en la aparición de numerosos adipocitos similares a adipocitos marrones y positivos para la UCP1 y para el marcador de adipocitos marrones CIDE-A. Además de nuestros estudios en el tejido adiposo, como un enfoque más innovador, analizamos la potencial utilidad del análisis de expresión génica de una fracción de células de la sangre (células mononucleares de sangre periférica, PBMC), para realizar estudios relacionados con la activación del TAM. Nuestros resultados indican que las PBMC pueden reflejar algunos de los patrones de regulación observados en TAM y en TAB en respuesta a la ingesta de dietas ricas en grasa, así como también a la marronización en respuesta a la exposición al frío. Por lo tanto, las PBMC podrían ser utilizadas como una fuente fácilmente obtenible de biomarcadores de adipocitos marrones/brite, útiles para realizar estudios en humanos con invasión mínima. Por último, además de su importante papel en el mantenimiento del peso corporal, la función del TAM está relacionada con la regulación de la sensibilidad a la insulina. Como parte de un estudio de colaboración dentro del proyecto europeo DIABAT, hemos establecido las condiciones experimentales para llevar a cabo un sistema condicionado in vitro entre adipocitos marrones/brite y células beta pancreáticas que podría ser una herramienta útil para comprender en detalle la comunicación cruzada entre el TAM y el páncreas. Además, presentamos resultados preliminares que muestran una influencia de las adipoquinas secretadas por el TAM en la secreción de insulina por células beta pancreáticas en cultivo. En resumen, los resultados de esta tesis proporcionan evidencia de que las dietas hiperlipídicas, especialmente cuando son administradas ad libitum y tienen mayor proporción de grasa, producen un impacto en el perfil de expresión génica de marcadores de marronización en TAB, lo cual es indicativo de una mayor capacidad de conversión a TAM. Además, hemos contribuido a caracterizar el efecto de la exposición al frío en el proceso de marronización del TAB, que es especialmente importante en animales jóvenes. Aunque es difícil conocer la relevancia fisiológica en el balance energético de un incremento en el potencial de marronización observado en nuestros estudios, la investigación sobre factores/condiciones capaces de inducir remodelación de TAB a TAM, los mecanismos moleculares que intervienen en este proceso y su control, son clave en para la comprensión de la regulación del balance energético y puede ayudar en la lucha contra la obesidad. De manera interesante, el aumento de la capacidad de marronización que se observa a nivel de ARNm en nuestros estudios siempre estaba asociado con un perfil de expresión génica claramente indicativo de la activación de las rutas metabólicas relacionadas con la movilización y oxidación de las grasas en los depósitos analizados. Además, demostramos la potencial utilidad de una fracción de células de la sangre fácilmente obtenibles, las PBMC, para reflejar el recruitment del TAM y el proceso de marronización del TAB en respuesta a los estímulos estudiados; el uso de material biológico no invasivo será extremadamente valioso para futuras investigaciones relacionadas con el TAM en humanos.

[cat] Les estratègies actuals per a combatre la obesitat no són totalment efectives i impliquen un repte econòmic per a la salut pública. En els darrers anys, degut al redescobriment del teixit adipós marró (TAM) induïble a adults humans, l’estudi d’aquest teixit dissipador d’energia ha ressorgit com una activa àrea de recerca per a intentar combatre l’obesitat. L’objectiu central de la present tesis doctoral va ser profunditzar en els efectes de la dieta i l’exposició al fred en la remodelació del teixit adipós blanc (TAB) a marró (procés de marronització), utilitzant rates com a principal model animal. Per això hem analitzat la capacitat de induir la marronització de diferents tipus de dietes: riques en greixos (dieta de cafeteria i dietes comercials riques en greixos, amb diferents continguts de greixos) o rica en proteïnes. També hem analitzat els efectes marronitzadors de l’exposició al fred a diferents edats del desenvolupament de la rata. Una elevada ingesta de greix es una de les principals causes de la obesitat, ja que l’excés de calories s’acumula en forma de greixos al teixit adipós. Es sap que les dietes hiperlipídiques incrementen el recruitment del TAM i els nivells de UCP1 per tal de contrarestar l’increment de l’adipositat. A més, els nostres resultats mostren com la ingesta crònica de dietes hiperlipídiques, especialment quan son administrades ad libitum (hipercalòric vs isocalòric) i amb una elevada proporció de greixos, poden induir l’aparició de característiques de adipòcits marrons en el TAB, de manera específica als diferents dipòsits, sent els depòsits inguinal i retroperitoneal els que tenen més capacitat de marronització. Aquestes dietes, principalment la dieta de cafeteria, tenen la capacitat de induir l’aparició d’un perfil d’adipòcits marrons o adipòcits brite en el TAB, incrementant l’expressió d’ARNm de marcadors de marronització claus; aquesta elevada capacitat de marronització es tradueix en l’aparició a nivell morfològic de adipòcits similars als marrons (brite) que expressen UCP1 en el depòsit retroperitoneal, que pareix ser particularment sensible a la marronització. La reversió de la dieta de cafeteria a una dieta control restableix molts dels canvis observats a nivell molecular i morfològic. A més, hem centrat la nostre atenció en el TAB que envolta el TAM, el TABis, que no havia estat molt estudiat. Hem descrit que aquest depòsit presenta un perfil molecular amb naturalesa de TAB però comparteix característiques del TAM i presenta una elevada capacitat de marronització en resposta a la ingesta de dieta de cafeteria en comparació a altres depòsits de TAB. Per tant, el TABis apareix com un depòsit interesant per a ser considerat en la recerca de la termogènesis, que podria contribuir significativament en el balanç energètic. A més dels greixos, es sap que el contingut proteic de la dieta també té un efecte en el balanç del pes corporal, i les dietes riques en proteïnes (HP) s’estan utilitzant de cada vegada més en estratègies de pèrdua de pes. S’ha proposat que les dietes HP podrien augmentar la termogènesis del TAM, no obstant, hi ha controvèrsia en els resultats. En aquesta tesi, hem analitzat l’efecte de l’administració crònica de una dieta HP rica en caseïna, i no hem trobat cap signe rellevant d’activació del TAM o de la remodelació del TAB a marró, ni a nivell molecular ni a nivell morfològic en els diferents depòsits analitzats que poguessin contribuir a la baixada de pes dels nostres animals. Aquesta discrepància amb altres autors posa en evidencia la importància de la quantitat i la font de les proteïnes utilitzades. L’exposició al fred és l’estímul termogènic més fort que, a més de activar el TAM, pot induir l’aparició de adipòcits brite al TAB. Es sap que la resposta al fred en el TAM es major a animals joves. En la present tesis, hem demostrat que la marronització del TAB en resposta al fred es també depenent de l’edat; l’exposició al fred incrementa la expressió de ARNm de l’Ucp1, tant al TAM com al TAB analitzat (dipòsit retroperitoneal), però tan sols a les rates d’un mes de vida. Altres marcadors d’adipòcits marrons o adipòcits brite també estaven afectats al TAB, a aquesta edat primerenca, i aquesta incrementada capacitat termogènica es va traduir en l’aparició d’un gran nombre de adipòcits similars a marrons positius per UCP1 i per el marcador de adipòcits marrons CIDE-A. A més dels nostres estudi en el teixit adipós, amb un enfocament més innovador, hem analitzat la potencial utilitat de l’anàlisi de expressió gènica a un conjunt de cèl·lules sanguínies (cèl·lules mononuclears de sang perifèrica, PBMC), per realitzar estudis de TAM. Els nostres resultats indiquen que les PBMC poden reflectir alguns dels patrons de regulació observats al TAM i TAB en resposta a la ingesta de dietes riques en greixos, així com la marronització en resposta a l’exposició al fred. Per tant, les PBMC poden ser utilitzades com una font fàcilment obtenible de biomarcadors d’adipòcits marrons i adipòcits brite molt útil per a realitzar estudis a humans amb una invasió mínima. Finalment, a part del seu important paper en el manteniment del pes corporal, la funció del TAM també està associada a la regulació de la sensibilitat a la insulina. Com a part d’un estudi en col·laboració dins el projecte Europeu DIABAT, hem establert les condicions experimentals per a realitzar un sistema in vitro condicionat entre adipòcits marrons i brite, i cèl·lules pancreàtiques que podria ser una eina útil per a profunditzar en la comprensió de la connexió entre el TAM i el pàncreas. A més, presentam resultats preliminars que mostren una influencia de les adipoquines secretades pel TAM en el control de la secreció de insulina de les cèl·lules pancreàtiques en cultiu. Tot en conjunt, els resultats de la present tesis proporcionen l’evidencia de que les dietes hiperlipídiques, especialment quan son administrades ad libitum i amb major proporció de greixos, produeixen un impacte en el perfil d’expressió de marcadors de marronització en el TAB, el que indica una major capacitat de conversió a TAM. També, hem contribuït a caracteritzar l’efecte de l’exposició al fred en el procés de marronització del TAB, el qual es especialment important a animals joves. Encara que sigui difícil conèixer la rellevància fisiològica en el balanç energètic d’un increment en el potencial de marronització observat als nostres estudis, la recerca de factors o condicions amb capacitat de remodelar el TAB en TAM, els mecanismes moleculars implicats en aquest procés i el seu control, és crucial en la comprensió de la regulació del balanç energètic i pot ajudar a la batalla contra l’obesitat. De manera interesant, la capacitat de marronització incrementada observada a nivell de ARNm en els nostres estudis estava sempre associada a un perfil d’expressió gènica clarament indicatiu de l’activació de les vies metabòliques associades a la mobilització i oxidació dels greixos en els depòsits adiposos analitzats. A més, hem demostrat la potencial utilitat d’una fracció de cèl·lules sanguínies fàcilment obtenible, PBMC, per reflectir el recruitment del TAM i la marronització del TAB en resposta als estímuls estudiats; la utilització de material biològic no invasiu serà extremadament valuós per a recerca futura relacionada amb el TAM a humans.